肺癌是临床上发病率最高的癌症之一，也是全球范围内恶性肿瘤死亡的常见原因之一^[1]。非小细胞肺癌是肺癌中最常见的病理类型，其早期诊断具有一定的难度，且5年生存率较低^[2]。肺癌发病早期多无典型临床表现，一经发现往往已经发展至中晚期，预后不佳。外泌体天然存在于人体体液中，其成分中含有mRNA、miRNA和蛋白质等能够携带重要生物信息的分子，肿瘤源性或肿瘤相关的外泌体含有丰富的生物成分，可作为信号信使参与前列腺癌发生、发展、进展和转移过程中细胞间通讯，是调节微环境的重要递质^[3]。由于这些外泌体可以从各种体液中分离出并检测到，已成为肿瘤诊断和预后有潜力的新的生物标记物。miRNA是一种非编码小分子RNA，可调节细胞的增殖、分化和凋亡，在肿瘤的诊断、预后和治疗中发挥重要作用^[4]。外泌体中的miRNA-486-3p在很多恶性肿瘤中均呈现异常表达，如肝癌、胰腺癌、肺癌或胰腺癌等^[5]。本研究通过检测并分析非小细胞肺癌病人和健康体检者血清外泌体miR-486-3p表达水平差异，探究血清外泌体miR-486-3p对非小细胞肺癌的早期诊断价值。现将结果报告如下。

2018年10月—2020年9月，选取本院收治的非小细胞肺癌病人120例为观察组，以同期本院体检的健康志愿者120例为对照组。观察组男93例，女27例；年龄40~79岁，平均(59.87±10.39)岁。病人纳入标准：①经影像学及病理检查确诊为非小细胞肺癌；②意识清楚，无精神系统疾病，认知正常，能够通过语言或行为与他人正常交流。排除标准：①肝肾功能严重不全者；②免疫系统疾病病人；③合并其他恶性肿瘤者；④除肺部以外其他恶性肿瘤病人。对照组男95例，女25例；年龄38~80岁，平均(60.34±11.27)岁。所有对照组受试者影像学检查、实验室检测均未见明显异常；意识清醒，无精神系统疾病。所有研究对象知情同意且研究通过本院伦理委员会审核批准。

采集两组受试者空腹静脉血5 mL，以4 000 r/min离心15 min，获取血清，应用Auto 2000发光仪(美国，SBI公司)检测血清中癌胚抗原(CEA)、糖类抗原125(CA125)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)及细胞角蛋白抗原片段21-1(CYFRA21-1)水平。应用Exo Quick-TM试剂(美国，SBI公司)提取血清外泌体，按照试剂说明书操作。用磷钨酸溶液染色法染色后，透射电镜(Olympus)观察外泌体颗粒形态，纳米颗粒跟踪分析(NTA)技术测定外泌体粒径大小。应用Western blot法检测外泌体表面蛋白标志物CD81和TSG101表达，实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测miR-486-3p水平。收集受试者一般资料，对病人手术后肿瘤组织病理学、肿瘤病灶最大直径等进行分析。

采用GraphPad Prism9软件进行统计学处理。计量资料结果以x±s表示，组间比较采用t检验；计数资料用百分比或例数表示，数据间比较采用χ²检验；P < 0.05表示差异有统计学意义。应用MedCalc 15.2.2软件绘制受试者工作特征(ROC)曲线，分析血清外泌体miR-486-3p诊断非小细胞肺癌的灵敏度和特异度。

透射电镜观察显示，外泌体具有脂质双层囊泡结构(图 1)；NTA技术观察结果显示，外泌体颗粒直径呈单峰正态分布，峰值处颗粒直径约为90 nm，颗粒主要分布于20~300 nm(图 2)。Western blot检测显示，外泌体表达CD81和TSG101表面标志蛋白(图 3)。

箭头所示为外泌体，磷钨酸溶液染色法染色，放大70 000倍。 图 1 血清外泌体形态透射电镜观察

图 2 NTA检测外泌体颗粒的直径分布

图 3 Western blot方法检测外泌体表面标志蛋白CD81以及TSG101表达

观察组血清CEA、CA125、NSE和CYFRA21-1水平均高于对照组(t=10.701~31.406，P < 0.01)，观察组血清外泌体miR-486-3p水平显著低于对照组(t=17.155，P < 0.01)。见表 1和图 4。

表1(Table 1)

表 1 两组间血清检测指标比较(n=120, x±s)

表 1 两组间血清检测指标比较(n=120, x±s) 分组 miR-486-3p CEA(ρ/μg·L－1) CA125(z/kU·L－1) NSE(ρ/μg·L－1) CYFRA21-1(ρ/μg·L－1) 对照组 1.10±0.33 4.50±2.11 10.68±3.69 10.11±5.36 4.70±2.80 观察组 0.56±0.10* 36.98±15.37* 25.42±3.58* 24.10±11.58* 13.47±8.53* 与对照组比较，*t=10.701~31.406，P < 0.01。

图 4 两组miR-486-3p表达比较

观察组高龄、男性、有淋巴转移性病灶及TNM分期Ⅲ~Ⅳ期病人的miR-486-3p表达水平均低于中青年、女性、无淋巴转移性病灶及TNM分期Ⅰ~Ⅱ期病人(t=8.168~19.658，P < 0.05)，而组织学诊断差异无统计学意义(P>0.05)。见表 2。

表2(Table 2)

表 2 不同病理特征非小细胞肺癌miR-486-3p表达比较(x±s)

表 2 不同病理特征非小细胞肺癌miR-486-3p表达比较(x±s) 病理特征 n miR-486-3p t P 性别 19.658 < 0.001   男 93 0.13±0.05   女 27 0.65±0.24 年龄(岁) 8.168 < 0.001   ≥60 25 0.17±0.07   40~59 95 0.60±0.26 TNM分期 14.196 < 0.001   Ⅰ~Ⅱ 53 0.62±0.18   Ⅲ~Ⅳ期 67 0.23±0.12 淋巴转移性病灶 19.574 < 0.001   有 54 0.25±0.08   无 66 0.59±0.11 组织学诊断 1.649 0.102   腺癌 70 0.53±0.24   鳞癌 50 0.61±0.29

ROC曲线分析显示，血清外泌体miR-486-3p诊断非小细胞肺癌的曲线下面积(AUC)为0.781，95%置信区间(CI)为0.724~0.839，诊断的灵敏度为51.67%，特异度为98.33%，最佳界值为0.945(图 5)。

图 5 miR-486-3p表达诊断非小细胞肺癌的ROC曲线

肺癌在临床上发病率较高，其病死率居恶性肿瘤首位，其中非小细胞肺癌病人占80%以上^[6]。很多病人在明确诊断时往往已经发展至中晚期，若早期明确诊断，采取手术等措施综合治疗，5年生存率能够显著提高^[7]。CEA、CA125、NSE、CYFRA21-1等肿瘤标志物是常见的肺癌筛查指标，但其灵敏度、特异度均较低，无法满足临床需求^[8]。低剂量螺旋CT具有发现早期病灶的能力，但却容易引起医生对疾病的误判，导致进行一些不必要的治疗；另外，频繁的CT检查也对病人的健康不利^[9]。其他检查，如支气管病理活检，属于有创检查，病人接受难度较高，对于早期非小细胞肺癌病人的诊断价值比较有限。因此，寻找特异度及灵敏度更高的检测方法是肺癌筛查的目标。

外泌体的本质是一种细胞外囊泡，其体积较小，直径通常介于20~300 nm范围内，它们主要由细胞分泌产生，并通过胞吐的方式释放进入各种体液，外泌体可在血液、尿液、汗液以及脑脊液等多种体液中存在^[10]。Exocarta数据库显示，已经发现的外泌体超过万种，在各种外泌体中，其组成成分包括蛋白质、mRNA、miRNA以及脂质^[11]。这些成分是体内新陈代谢的重要物质，参与体内的物质交换，因此它们在肿瘤发生的早期即可出现一定的变化，对肿瘤早期诊断以及治疗后病情的评估都有着重要的意义，已成为肿瘤血清生物标记研究的热点^[12]。

本文研究主要检测血清外泌体中的miRNA。miRNA属于非编码RNA，能够通过mRNA的靶向互补作用而达成对基因表达的调控作用。目前研究认为，miRNA在肿瘤发生发展及转移的过程中有一定的临床作用，这也是癌症治疗中的新思路。有研究表明，miRNA在恶性肿瘤病人体内多呈异常表达，与多种恶性肿瘤病人的预后关系密切，具有一定的早期诊断价值。本文结果显示，观察组血清CEA、CA125、NSE、CYFRA21-1的水平均高于对照组，而血清外泌体miR-486-3p水平低于对照组，提示检测肿瘤标志物能一定程度筛选出肺癌病人。

TNM是分析肺癌的病理类型、浸润程度等方面的常用分型方式。本文研究结果显示，观察组高龄、男性、有淋巴转移性病灶及TNM分期Ⅲ~Ⅳ期病人的miR-486-3p表达水平均低于中青年、女性、TNM分期Ⅰ~Ⅱ期、无淋巴转移性病灶者。提示肿瘤细胞恶化程度越高，miR-486-3p表达水平可能越低。

综上所述，非小细胞肺癌在肺癌中比较常见，预后较差，早期诊断并及时予以治疗措施，能够延长病人生存时间。血清外泌体miR-486-3p属于常见抑癌miRNA，在非小细胞肺癌中呈现低水平表达，且非小细胞肺癌病人恶化程度越高，血清外泌体miR-486-3p表达水平越低，二者之间呈负相关，提示血清外泌体miR-486-3p对非小细胞肺癌具有一定的早期诊断价值。外泌体miRNA是外泌体的重要组成部分，在机体免疫、疾病进展，尤其是肿瘤的发生、发展、变化中都有参与。但是目前，临床上对于外泌体的研究还处于基础阶段，在理论体系方面尚不完善，并且在科研投入和技术支持方面都存在一定的欠缺，有待进一步深入。外泌体中的很多组成部分均有望成为疾病的无创生物标志物，为疾病的早期发现、预后评估提供可靠的临床依据。