2025, Vol. 61
2. 兰州大学第二医院骨科
骨质疏松(OP)病人发生的骨折称为骨质疏松性骨折(OPF)[1]。OPF病人骨量减少、骨小梁结构恶化，OPF致残率远高于常规骨折(CF)[2-3]。OPF的治疗需要处理骨折和抗OP治疗，而中药被发现具有促进骨折愈合和改善OP的作用，具有安全、副作用少等优势[4-5]。柚皮苷(NAR)是中药骨碎补的重要成分，具有抗OP和抗炎作用，不仅可通过抑制骨吸收、促进骨形成和增加骨量治疗OP，还可以改善老年大鼠的OPF[6-9]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是三磷酸腺苷的下游分子，激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)能够增加三磷酸腺苷合成、促进骨形成，并抑制mTOR的合成，且激活AMPK/mTOR信号通路能够改善绝经后OP[10-12]。本研究基于AMPK/mTOR信号通路探讨NAR在OPF大鼠骨折愈合过程中的作用，以期为OPF的治疗提供理论和实验依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物SPF级Sprague Dawley(SD)雌性大鼠84只，23月龄，体质量为550~600 g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司(SCXK(鲁)2019-0003)。大鼠分笼饲养在20~24 ℃、相对湿度50%~60%、12 h/12 h昼夜等长循环光照条件下，期间可自由饮水和摄食。适应性饲养7 d后用于实验。动物实验获得古浪县人民医院动物伦理委员会的批准。
1.2 主要试剂与仪器NAR(浓度99.95%)购自河南莱尔因生物科技有限公司；苏木精-伊红(HE)染色试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天科技有限公司；AMPK抑制剂Compound C(CC)购自美国MCE公司；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OC)与Ⅰ型胶原C端肽(CTX-Ⅰ)ELISA试剂盒购自南京建成生物工程研究所；ECL化学发光剂购自上海翊圣生物科技公司；兔源AMPK、mTOR、p-AMPK、p-mTOR一抗和相应二抗购自美国Abcam公司。X线骨密度扫描仪(HOLOGIC4500 A型)购自美国Hologic公司；多功能酶标仪(ELX-800)购自美国Bio-Tek公司。
1.3 实验方法 1.3.1 大鼠OP模型的建立采用双侧卵巢摘除法建立大鼠OP模型[13]。所有大鼠用戊巴比妥钠麻醉，随机选取54只大鼠经背部入路切除双侧卵巢后缝合。其余30只大鼠只切开皮肤，不切除卵巢。正常饲养3个月后，从切除卵巢和未切除卵巢的大鼠中各随机选取6只，在麻醉下进行骨密度测定，以确认OP模型建立成功。
1.3.2 大鼠OPF模型的建立从OP造模成功的大鼠中选取48只，从未切除卵巢的大鼠中随机选取12只，用戊巴比妥钠麻醉，于大鼠右侧股骨处备皮并消毒。在大鼠股骨中点外侧行纵切，用小钢锯锯断股骨，用克氏针髓内固定，然后缝合，分别构建大鼠OPF模型和CF模型[13]。其余12只未切除卵巢的大鼠仅纵向切开股骨，不锯断，直接缝合，记为正常组(Normal组)。
1.3.3 实验动物分组与给药将48只构建成功的OPF模型大鼠采用随机数字表法分为低剂量NAR(NAR-L，150 mg/kg NAR)组、高剂量NAR(NAR-H，300 mg/kg NAR[14])组、高剂量NAR+AMPK抑制剂CC(NAR-H+CC，给予300 mg/kg NAR+0.2 mg/kg CC[15])组和OPF组，每组12只。模型建立后，每组大鼠按照相应剂量进行药物干预。NAR采用灌胃给药，CC采用腹腔注射给药，每日1次，共28 d。将造模成功的12只未切除卵巢的大鼠记为CF组。OPF组、CF组和Normal组分别给予与NAR-H等量的生理盐水灌胃，与CC等量的生理盐水腹腔注射；NAR-L组和NAR-H组大鼠给予相应剂量的NAR灌胃，与CC等量的生理盐水腹腔注射。
1.3.4 骨密度扫描仪测定骨密度末次给药后，将大鼠麻醉，采集腹主动脉血，在4 ℃下以3 000 r/min离心10 min，分离血清，分装后在-20 ℃下保存。之后处死所有大鼠，解剖取右侧股骨，去除软组织，在X线骨密度扫描仪中测定骨密度。
1.3.5 三点弯曲实验测定股骨生物力学参数每组随机取3只大鼠的股骨组织，通过三点弯曲实验分析股骨生物力学[16]。支点跨距为20 mm，加载速度为2 mm·min-1，施加压力让骨头断裂。通过计算机对弯曲强度和最大载荷进行分析和计算。
1.3.6 苏木精-伊红(HE)染色观察骨折部位骨痂组织形态学变化随机选取3只大鼠，用40 g/L多聚甲醛固定其骨痂组织。在100 g/L的EDTA中脱钙4周后，进行常规石蜡包埋、切片和HE染色，光镜下观察各组大鼠骨痂组织的形态学变化。其余6只大鼠的骨痂组织在-80 ℃下冻存。
1.3.7 免疫组织化学法检测骨痂组织中ALP、骨形态发生蛋白2(BMP-2)蛋白表达将1.3.6中制备的石蜡切片脱蜡、水化，置于抗原修复液中15 min。内源酶灭活并封闭切片后，加一抗ALP(1∶80)和BMP-2(1∶100)于4 ℃孵育，次日用山羊抗兔IgG H&L(HRP，1∶2 000)二抗孵育。利用辣根过氧化物酶-链霉亲和素系统进行免疫组化染色的信号可视化。在光学显微镜下对选定区域进行拍照，并计算棕黄色染色的阳性细胞数。
1.3.8 酶联免疫吸附测定(ELISA) 法检测取1.3.4冻存的血清，按照ELISA试剂盒说明检测TNF-α、IL-6、IL-1、ALP、CTX-Ⅰ与OC的水平。
1.3.9 蛋白免疫印迹(Western blot)法检测骨痂组织AMPK、mTOR的表达将RIPA裂解液加入1.3.6中冻存的骨痂组织中，4 ℃下振荡裂解5 min后收集各组总蛋白。采用BCA方法对各组蛋白浓度进行定量。电泳、转膜后，用胎牛血清在37 ℃下封闭2 h，将膜与一抗AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR(1∶1 000)在4 ℃下孵育过夜，次日滴加二抗(1∶3 000)室温孵育2 h。采用ECL化学发光剂曝光条带，并用Image Lab软件计算目的蛋白的相对表达量。
1.4 统计学分析采用Graph Pad Prism 7.0软件进行统计学分析。计量资料数据以x±s表示，多组比较采用单因素方差分析和LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 NAR对大鼠股骨骨密度的影响骨密度测定结果显示，各组大鼠股骨骨密度比较，差异均有统计学意义(F=304.608，P＜0.001)。与Normal组和CF组比较，OPF组股骨骨密度显著下降(P＜0.05)；与OPF组和NAR-L组比较，NAR-H组股骨骨密度显著升高(P＜0.05)；与NAR-H组比较，NAR-H+CC组股骨骨密度显著下降(P＜0.05)。CF组与Normal组以及NAR-L组与OPF组股骨骨密度比较，差异均无显著意义(P＞0.05)。见表 1。
| 表 1 各组大鼠股骨骨密度、最大载荷和抗弯强度的比较(n=12，x±s) |
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三点弯曲实验结果显示，各组大鼠股骨最大载荷、抗弯强度相比较，差异均有统计学意义(F=67.788、58.766，P＜0.001)。与Normal组和CF组比较，OPF组股骨最大载荷、抗弯强度均显著下降(P＜0.05)；与OPF组和NAR-L组比较，NAR-H组股骨最大载荷、抗弯强度显著升高(P＜0.05)；与NAR-H组比较，NAR-H+CC组股骨最大载荷、抗弯强度显著下降(P＜0.05)。CF组与Normal组以及NAR-L组与OPF组股骨最大载荷、抗弯强度比较，差异均无显著性(P＞0.05)。见表 1。
2.3 NAR对大鼠骨痂组织形态学的影响HE染色结果显示，CF组大鼠骨痂组织骨小梁分布规则，排列规整，间距较小，厚度均匀，有片状骨形成。而OPF组大鼠骨痂组织的骨小梁分布不均匀，排列紊乱，且较细，髓腔间隙变大，疏松性明显，且有明显的炎性细胞浸润，炎性因子明显增多。与OPF组比较，NAR-L组、NAR-H组大鼠骨痂组织的骨小梁数量增多，形态变粗，间距减小，炎性细胞浸润减少，骨性骨痂组织增多，其中NAR-H组大鼠的骨痂组织炎性细胞浸润减轻更为明显。与NAR-H组比较，NAR-H+CC组大鼠骨痂组织的骨小梁变细，形态变疏松，炎性浸润明显。见图 1。
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| HE染色，200倍。 图 1 NAR对各组大鼠骨痂组织形态学的影响 |
免疫组织化学染色结果显示，各组大鼠骨痂组织ALP、BMP-2阳性细胞率比较，差异均有统计学意义(F=391.646、315.112，P＜0.001)。与Normal组和CF组比较，OPF组大鼠骨痂组织ALP、BMP-2阳性细胞率显著降低(P＜0.05)；与OPF组和NAR-L组比较，NAR-H组的ALP、BMP-2阳性细胞率明显增高(P＜0.05)；与NAR-H组相比较，NAR-H+CC组的ALP、BMP-2阳性细胞率显著降低(P＜0.05)。CF组与Normal组、NAR-L组与OPF组骨痂组织ALP、BMP-2阳性细胞率比较，差异均无显著性(P＞0.05)。见图 2、表 2。
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| 免疫组织化学染色，200倍。 图 2 NAR对各组大鼠骨痂组织ALP、BMP-2蛋白表达的影响 |
| 表 2 各组大鼠骨痂组织ALP、BMP-2阳性细胞率比较(n=12，χ/%，x±s) |
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ELISA法检测结果显示，各组大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-6水平比较，差异均有统计学意义(F=193.734~279.318，P＜0.001)。与Normal组和CF组比较，OPF组TNF-α、IL-1、IL-6因子水平均显著升高(P＜0.05)；与OPF组和NAR-L组相比较，NAR-H组TNF-α、IL-1、IL-6因子水平显著降低(P＜0.05)；与NAR-H组比较，NAR-H+CC组TNF-α、IL-1、IL-6因子水平显著升高(P＜0.05)。CF组与Normal组以及NAR-L组与OPF组血清TNF-α、IL-1、IL-6水平比较，差异均无显著性(P＞0.05)。见表 3。
| 表 3 各组大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-6水平的比较(n=12，x±s) |
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ELISA法检测结果显示，各组大鼠血清ALP、CTX-Ⅰ以及OC水平比较，差异均有统计学意义(F=69.418~171.493，P＜0.001)。与Normal组和CF组比较，OPF组ALP、OC水平显著下降，CTX-Ⅰ水平显著上升(P＜0.05)；与OPF组和NAR-L组比较，NAR-H组ALP、OC水平显著上升，CTX-Ⅰ水平显著下降(P＜0.05)；与NAR-H组比较，NAR-H+CC组ALP、OC水平显著下降，CTX-Ⅰ水平显著上升(P＜0.05)。CF组与Normal组以及NAR-L组与OPF组血清ALP、CTX-Ⅰ和OC水平相比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。见表 4。
| 表 4 各组大鼠血清ALP、CTX-Ⅰ和OC水平的比较(n=12，x±s) |
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Western blot法检测结果显示，各组大鼠骨痂组织AMPK、mTOR蛋白的磷酸化水平比较，差异均有统计学意义(F=106.677、134.086，P＜0.001)。与Normal组和CF组比较，AMPK磷酸化水平显著下降，mTOR磷酸化水平显著上升(P＜0.05)；与OPF组和NAR-L组相比较，NAR-H组AMPK磷酸化水平显著上升，mTOR磷酸化水平显著下降(P＜0.05)；与NAR-H组比较，NAR-H+CC组AMPK磷酸化水平显著下降，mTOR磷酸化水平显著上升(P＜0.05)。CF组与Normal组以及NAR-L组与OPF组骨痂组织AMPK、mTOR蛋白的磷酸化水平比较，差异均无显著性(P＞0.05)。见表 5、图 3。
| 表 5 各组大鼠骨痂组织AMPK、mTOR蛋白磷酸化水平的比较(n=12，x±s) |
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| 图 3 各组大鼠骨痂组织AMPK、mTOR蛋白磷酸化水平的Western blot检测 |
OP是破骨和成骨过程失衡导致骨代谢紊乱的结果，病人更容易发生骨折。绝经后女性是OP的主要发病人群，主要原因是雌激素缺乏。目前，OPF已成为医疗系统和整个社会面临的挑战[17]。OPF的骨折愈合受应激反应、激素分泌、生长因子支持等多种因素和过程的影响，OPF的临床治疗主要依靠基础营养补充剂和促骨形成药物来抑制骨吸收，减少骨量丢失[18]。然而，所使用的化学药物有许多副作用。因此，寻找安全有效的促进OPF病人骨折愈合的药物将有利于改善治疗效果。
NAR是一种由葡萄糖、鼠李糖等组成的天然黄酮化合物，临床上发现其对OP和骨折愈合有良好的治疗作用[19]。上官姬等[20]的研究表明，NAR可以调节OP大鼠的骨代谢，提高骨密度，发挥抗OP作用。其机制可能与调节低氧诱导因子-1/血管内皮生长因子信号通路和促进H型血管形成有关。WANG等[21]研究表明，NAR可通过靶向酪氨酸激酶2/信号转导和转录激活因子3信号传导促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，延缓OP的进展。本文研究结果显示，高剂量NAR治疗后，OPF大鼠股骨的骨密度、最大载荷、抗弯强度均增加，骨小梁数量增多、形态变粗、间距减小，与刘小坡等[9]研究结果一致，提示NAR可以增强老年OPF大鼠股骨的生物力学性能。ALP是骨矿化的必需物质，其活性反映骨形成和骨转换的程度；OC是成骨细胞活性的标志物；CTX-Ⅰ是骨吸收的生物标志物，其水平在正常状态下较低[22]。BMP-2与骨的形成和重建有关，增加其表达可促进成骨细胞的分化[23]。本文研究结果显示，高剂量NAR治疗可增加血清ALP、OC水平及骨痂组织ALP和BMP-2的表达，降低CTX-Ⅰ水平，提示NAR可促进老年OPF大鼠骨形成，抑制骨吸收，影响骨形成和骨转换。一项临床研究证实，绝经后OP病人的炎症因子增加，尤其是IL-1β、IL-6和TNF-α[24]。最近的动物实验表明，OPF大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平增高，而补中益气汤可通过抑制这些因子的分泌来抵抗OPF炎症[25]。本文研究结果显示，高剂量NAR能显著降低血清TNF-α、IL-1、IL-6水平，提示NAR对OPF炎症具有治疗作用。上述研究结果证实，NAR可促进老年OPF大鼠骨折愈合，提示NAR可能是未来治疗OPF的潜在药物之一。此外，本文研究结果显示，NAR能抑制老年OPF大鼠的炎症浸润和炎症因子的分泌，并能调节ALP、BMP-2等与骨形成和吸收相关标志物的表达，这与既往的研究结果有所不同[9, 26-27]。
AMPK/mTOR是调节细胞自噬的经典信号通路，在骨代谢中也发挥重要作用。AMPK可维持代谢稳态，并因其具有促进自噬的能力在成骨过程中发挥重要作用[28]。mTOR是一种进化保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，受营养状态和细胞能量的直接调节，在自噬的调控中发挥重要作用[29]。研究表明，激活AKT/mTOR信号通路可抑制自噬，促进细胞分化，最终发挥抗OP的作用[12]。马伟凤等[30]研究发现，人参皂苷Rg3可以通过调节AMPK/mTOR信号通路促进自噬，提高老年OP大鼠骨密度，改善骨微结构，发挥骨保护的作用。基于上述研究结果，推测激活AMPK/mTOR信号通路可以对OPF发挥良好的治疗作用，AMPK和mTOR都可能成为OPF的治疗靶点[31-33]。本文研究结果显示，老年OPF大鼠骨痂组织中AMPK磷酸化水平显著降低，而mTOR磷酸化水平显著升高，表明老年OPF大鼠AMPK/mTOR信号通路受阻[34]。高剂量NAR治疗后，骨痂组织AMPK磷酸化水平上调，mTOR磷酸化水平下调，提示AMPK/mTOR信号通路的激活可能介导了NAR对OPF大鼠骨折愈合的促进作用[35]。为了进一步验证NAR与AMPK/mTOR信号通路在老年OPF大鼠模型中的调控作用，本研究设立了高剂量NAR+AMPK抑制剂CC组，结果显示，CC逆转了NAR对老年OPF大鼠骨折愈合的促进作用，再次验证了上述推测[36]。NAR对老年OPF大鼠AMPK/mTOR信号通路的激活与既往研究不同，这也是本研究的创新之处[37]。
综上所述，NAR可通过激活AMPK/mTOR信号通路促进骨形成，抑制骨吸收和炎症反应，从而促进OPF大鼠骨折愈合。本研究为OPF骨折愈合的临床治疗提供了参考和依据。但本研究存在以下局限性：①NAR是直接激活AMPK/mTOR信号通路，还是间接激活该通路促进骨折愈合尚未阐明；②可能还有其他通路参与NAR介导的OPF骨折愈合。在后续的深入研究中，将针对上述不足优化实验设计。
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