2024, Vol. 60
血管平滑肌细胞(VSMCs)异常增殖和迁移在高血压血管重构中发挥关键作用[1-2]。内皮素-1(ET-1)在VSMCs中表现出促有丝分裂、肥大反应的作用[3-4]，还参与高血压、心力衰竭和动脉粥样硬化等多种心血管疾病的病理过程[5-8]。抑制ET-1诱导的VSMCs异常增殖和迁移，可以抑制上述病理进程[9]。anoctamin-1(ANO1或TMEM16A)是一种钙激活氯通道，涉及腺上皮分泌、平滑肌收缩、心肌生物电和感觉信号转导等多项功能[10-11]，在VSMCs中广泛表达[12]，在自发性高血压大鼠和肺动脉高压大鼠中参与血管重构的发生[13-14]。本研究通过检测增殖细胞核抗原(PCNA)，进一步观察ANO1特异性抑制剂T16Ainh-A01(A01)对ET-1诱导的细胞增殖的影响，通过检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和骨桥蛋白(OPN)探讨A01可能的作用机制。
1 材料与方法 1.1 试剂与仪器ET-1购自上海AbMole公司，A01购自Sigma公司，PCNA抗体由Cell Signaling Technology公司提供，α-SMA和OPN抗体购自Abcam公司，β-actin抗体由北京博奥森公司提供，DMEM高糖培养液购自Gibco公司，胎牛血清购自美国BI公司，BCA蛋白测定试剂盒由上海Thermo公司提供，RIPA裂解液购自上海碧云天生物科技研究所，其他试剂均为国产分析纯。ET-1使用无菌水配成1 mmol/L的母液，A01用二甲基亚砜(DMSO)配成10~20 mmol/L的母液，使用前均用DMEM培养液稀释到终浓度。实验所用仪器包括CO2培养箱、超净工作台、Eppendorf高速离心机、37 ℃恒温孵育箱、多功能酶标仪以及Western显影仪等。
1.2 VSMCs的原代培养选用体质量70~100 g(大约3周龄)的Wistar大鼠，以400 mg/kg水合氯醛腹腔注射麻醉。用体积分数为0.75的乙醇浸泡消毒后，置于无菌超净工作台内。迅速分离胸主动脉，将动脉放入加DMEM培养液的玻璃皿中，去除血管外结缔组织，沿中线剪开，用弯镊子轻柔刮下内皮，用眼科剪将其剪成大小约1 mm3小块，平铺于50 mL培养瓶底部，加入含有体积分数0.20胎牛血清的DMEM高糖培养液4~5 mL，直立放入培养箱内，5~6 h后翻瓶，培养1周左右，在显微镜下可看到贴壁组织块周围有VSMCs爬出，细胞融合达到60%~70%时进行传代，选择第5~8代生长良好的细胞进行后续实验。
1.3 实验分组将VSMCs分为对照组(A组，无药物处理)、ET-1组(B组，用1 nmol/L ET-1处理)、ET-1+A01组(C组，同时加入1 nmol/L ET-1和20 μmol/L A01)、A01组(D组，用20 μmol/L A01处理)，药物处理24 h后提取蛋白进行检测。
1.4 Western blot检测药物处理结束后用RIPA裂解液提取蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。所有样品上样量均为20 μg，经SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜上。用含100 g/L脱脂奶粉的TBST封闭1 h后，分别加入抗PCNA(1∶2 000)、α-SMA(1∶30 000)、OPN(1∶1 000)和β-actin(1∶8 000)抗体等一抗，4 ℃摇床孵育过夜。以TBST洗膜3次后，加入HRP标记的二抗，室温孵育1 h，ECL发光液显影，用Image J软件分析条带的灰度值。实验重复5次。
1.5 统计学分析所得数据以x±s表示，应用SPSS 22.0软件采用2×2析因设计的方差分析进行统计学分析，P＜0.05认为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 A01对PCNA蛋白表达的影响析因设计的方差分析显示，ET-1的主效应明显(F=16.755，P＜0.01)，A01的主效应无统计学意义(F=3.187，P>0.05)，ET-1和A01之间有交互作用(F=9.028，P＜0.01)。单独效应分析显示：与对照组比较，ET-1组PCNA蛋白表达明显上调(F=25.190，P＜0.01)；与ET-1组比较，ET-1+A01组PCNA蛋白表达明显下降(F=11.472，P＜0.01)；单独使用A01对PCNA蛋白表达没有明显影响(F=0.743，P>0.05)。提示单独应用ET-1可明显促进PCNA蛋白的表达，ET-1的作用可被A01所拮抗。见图 1、表 1。
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| A：对照组；B：ET-1组；C：ET-1+A01组；D：A01组。 图 1 各组PCNA、α-SMA、OPN蛋白表达的Western blot检测 |
| 表 1 各组PCNA、α-SMA、OPN蛋白表达的比较(n=5，x±s) |
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析因设计的方差分析显示，ET-1的主效应明显(F=10.306，P＜0.01)，A01主效应无统计学意义(F=3.853，P>0.05)，两种药物之间有交互作用(F=9.612，P＜0.01)。单独效应分析显示：与对照组比较，ET-1组α-SMA蛋白表达明显下降(F=19.912，P＜0.01)；与ET-1组比较，ET-1+A01组α-SMA蛋白表达明显上调(F=12.818，P＜0.01)；单独使用A01对α-SMA蛋白表达没有明显影响(F=0.647，P>0.05)。提示单独应用ET-1可使α-SMA蛋白水平升高，应用A01可阻断ET-1的作用。见图 1、表 1。
2.3 A01对OPN蛋白表达的影响析因设计的方差分析显示，ET-1和A01的主效应均无统计学意义(F=1.940、2.755，P>0.05)，两种药物之间有交互作用(F=9.201，P＜0.01)。单独效应分析显示：与对照组比较，ET-1组OPN蛋白表达明显上调(F=9.795，P＜0.01)；与ET-1组比较，ET-1+A01组OPN蛋白表达明显下降(F=11.013，P＜0.01)；单独使用A01对OPN蛋白表达没有明显影响(F=0.943，P>0.05)。提示单独应用ET-1可使OPN蛋白水平升高，应用A01可阻断ET-1的作用。见图 1、表 1。
3 讨论长期的高血压可导致血管结构和功能的改变，又称血管重构，血管重构和高血压的发展及重要靶器官损伤密切相关[15-16]。VSMCs作为血管壁的主体细胞，其异常的增殖迁移在高血压血管重构中发挥重要作用。体内多种因素，如血流动力学改变、血管活性物质(如血管紧张素Ⅱ、ET-1)、炎症因子和生长因子(如成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子等)，均与VSMCs功能异常密切相关[17-20]。
ET-1是内皮细胞分泌的最重要的血管活性物质，具有很强的缩血管效应；ET-1也是一种有丝分裂原，在维持血管功能稳态中具有重要作用[3]。通常认为，ET-1诱导VSMCs异常增殖迁移与其结合ETA受体后导致胞内钙增加、AKT和ERK信号通路激活等有关[21-22]。
最近研究发现，钙激活氯通道ANO1也是参与VSMCs功能调控的重要调控因子[13, 23-25]。ANO1激活可诱导VSMCs收缩，而抑制其功能性表达则通过舒张血管降低血压[23-24]。在自发性高血压大鼠中，VSMCs上ANO1功能性高表达促进高血压形成[13]。此外，ANO1还可以作为一种细胞增殖调节因子参与VSMCs增殖，促进血管重构和降低血管弹性[26-28]。
我们的前期研究发现，ET-1能够明显上调VSMCs的ANO1表达[15]。本研究利用ANO1特异性抑制剂A01进一步探讨了ANO1高表达是否参与了ET-1诱导的VSMCs增殖。PCNA是DNA合成中重要的辅助因子，也是检测细胞增殖最常用的指标。本研究PCNA检测结果表明，A01可明显抑制ET-1诱导的VSMCs增殖。
正常的VSMCs呈现出高度分化、低增殖能力的收缩表型，其作用是调节血管壁张力及维持组织血流量，其标志性蛋白主要为α-SMA和平滑肌22α等；合成型VSMCs呈低分化，可分泌大量细胞外基质，参与血管壁形成、损伤修复等，其标志性蛋白主要为OPN。VSMCs可由收缩型转化为合成型，后者具有强大的增殖迁移能力从而促进血管重构的发生[29-30]。为进一步探讨A01的作用机制，本实验又检测了SMA和OPN蛋白的表达。结果显示，ET-1处理细胞24 h后，α-SMA表达降低而OPN表达升高，即ET-1能够诱导VSMCs由收缩型转化为合成型，促进细胞增殖，而应用A01可明显阻断上述变化。根据已有的研究文献，我们推测A01对细胞表型的调控可能与它抑制PI3K/AKT和ERK信号通路有关[26-27]。
综上所述，ANO1特异性抑制剂A01对ET-1诱导的VSMCs增殖有明显的抑制作用，其作用可能与A01抑制ET-1诱导的细胞表型转换有关，这为ET-1引发的高血压、心力衰竭和动脉粥样硬化等多种心血管疾病的治疗提供了依据。
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