肺癌是世界范围内发病率及病死率最高的恶性肿瘤之一，据美国癌症协会统计，2020年全球肺癌新增病例和新增死亡病例在所有癌症中的占比分别是11.4%和18.0%^[1]。在我国，肺癌病人5年生存率仅为19.7%^[2]。肺癌预后较差主要与多数病人初诊时已经处于疾病晚期相关，实现肺癌的早诊断早治疗是降低病死率、改善预后的重要手段。液体活检作为一种新兴的体外检测方法，在肺癌的早期诊断中有重要价值。本文拟对国内外液体活检诊断早期肺癌的研究进展作一综述。

1 液体活检概述

液体活检以血液、痰液、肺泡灌洗液等为检测样本，检测体液中循环肿瘤细胞(CTC)、循环肿瘤DNA(ctDNA)、外泌体等生物标志物，近年来在肿瘤诊治领域获得了越来越多的关注，2020年被Nature杂志网站评选为肿瘤诊治领域的里程碑事件之一。

相对于传统的组织活检，液体活检有安全无创、标本易获取、可重复取材等优势，在提高临床依从性、克服肿瘤异质性等方面有重要价值。当前许多研究已表明，液体活检在肿瘤筛查、用药指导、疗效检测、预后判断等临床实践中都有着巨大的前景。

2 液体活检在早期肺癌诊断中的应用 2.1 CTC

CTC于1869年首次在外周血中被发现^[3]，指由于各种作用从原发性或转移性的肿瘤组织中脱落而进入外周体液循环中的肿瘤细胞，是目前除循环游离DNA(cfDNA)外应用最多的液体活检生物标志物^[4]。

ILIE等^[5]对168例慢性阻塞性肺疾病(COPD)、77例非COPD病人进行CTC检测，结果显示，COPD组5例血液标本中检测到了恶性CTC，随访发现该5例病人后续都发生了肺癌，证明了CTC在早期肺癌筛查中的重要意义。HE等^[6]检测了24例Ⅰ期和Ⅱ期非小细胞肺癌(NSCLC)病人、72例健康对照者外周血CTC，其诊断灵敏度和特异度分别为62.5%和100.0%，说明了CTC对于肺癌早期筛查与诊断的潜在价值。

CTC的检测分富集分离、鉴定分析两步进行。首先通过密度梯度离心法、免疫磁珠吸附法等依赖于CTC物理学、生物学特征的方法富集CTC，继而通过聚合酶链式反应(PCR)、细胞免疫荧光等方法对其进行分析^[7]。其中免疫磁珠吸附法包括阳性富集和阴性富集，前者依赖于偶联上皮细胞黏附分子(EpCAM)和细胞角蛋白等富集CTC，而后者依赖于偶联CD45等标志物去除非肿瘤细胞^[8]。CellSearch是美国食品药品监督管理局唯一批准用于临床的CTC检测技术，该技术通过EpCAM抗体包被的磁珠结合CTC表面的EpCAM进行免疫分离^[9]，但EpCAM易受上皮间质化影响，其诊断灵敏度欠佳且容易出现假阳性^[10]。叶酸受体(FR)免疫磁珠负向筛选联合靶向PCR，能靶向定量检测FR阳性的CTC^[11]，该方法不受上皮间质化的影响，弥补了CellSearch的部分不足。一项研究将FR靶向PCR CTC检测应用于肺癌，发现良性肺结节病人的CTC水平显著低于肺癌病人，该方法诊断肺癌的灵敏度和特异度分别为82.5%和72.2%，尤其对于Ⅰ期肺癌灵敏度可达86.8%，曲线下面积(AUC)可达0.912^[12]，证明该方法对于早期肺癌有较好的辅助诊断价值。此外，近年也有一些获得关注较多的其他CTC检测技术，如CTCBIOPSY、微腔阵列(MCA)系统、微流控技术等，其肺癌检出率的对比见表 1。

2.2 ctDNA

cfDNA是细胞以衰老、凋亡、坏死等方式释放到体液循环中的游离DNA，主要包括正常组织细胞释放的DNA、肿瘤细胞释放的DNA，后者称为ctDNA。ctDNA本质上是肿瘤组织的基因组片段，携带肿瘤细胞突变、插入、缺失、重排等基因组信息。

CHEN等^[17]通过靶向测序检测Ⅰ~Ⅲ期NSCLC病人的ctDNA和肿瘤组织DNA，发现了频繁的驱动突变，该方法的诊断灵敏度和特异度分别为53.8%和47.3%。一项有关肺结节良恶性的研究显示，ctDNA对于肺癌检出的总体特异度为96.0%，灵敏度为69.0%^[18]。因此，ctDNA被视作良好可靠的生物标记物，对于肺结节良恶性的定性诊断及早期肺癌的检出有很大的价值。

基于上述研究和高通量测序(NGS)、数字PCR等检测技术，ctDNA的检测在肺癌的诊治领域已有了部分应用，但仍面临着在体液中含量低、清除速度快、敏感性低、缺乏统一检测标准等问题。因此，ctDNA检测在肿瘤临床诊治中的应用仍需克服相关技术难题以提高其可靠性和准确性。

2.3 外泌体

外泌体是由细胞分泌到细胞外的囊泡，内含母细胞来源的DNA、微小RNA(miRNA)、蛋白质等成分，具有脂质双分子层结构，在外周血、唾液、痰液、肺泡灌洗液等体液中均能检测到，可通过自分泌或旁分泌的方式影响细胞间的物质交换和信息传递^[19]，参与肿瘤的发生发展、侵袭、转移。

ZHANG等^[20]研究发现，外泌体中miR-5684和miR-125b-5p水平在NSCLC病人体内明显降低，二者联合诊断NSCLC的AUC为0.793，灵敏度和特异度分别为82.7%和62.1%，其中对于早期肺癌病人鉴别的灵敏度和特异度分别为80.6%和60.9%，证明了外泌体在区分肺癌病人和非肺癌病人方面的潜在价值。

外泌体的分离常采用超速离心法、免疫磁珠法、聚乙二醇沉淀法等，再通过电子显微镜、免疫金标记技术、实时荧光定量PCR等方法分析鉴定^[21]，其优势在于体液中相对丰度高、外层的脂质双分子层使其结构较稳定，有益于内容物的提取分析。但外泌体的检测还存在着许多问题，比如并未建立一套分离提纯的标准程序，上述提到的离心法、免疫吸附法等都有造成蛋白质污染的可能^[22]，对实验研究造成了较大的阻碍。总之，当前外泌体检测难度大，检测方法仅局限于实验室层面，在实际临床应用中不确定因素较多，克服技术难题、使其早日走向临床应用仍任重而道远。

2.4 miRNA

miRNA是可以通过蛋白质-miRNA复合体、外泌体、肿瘤相关血小板(TEP)等物质携带释放的非编码RNA，长度约为18~25个核苷酸^[23]，能够对基因的转录、翻译进行复杂的调控从而参与机体的病理生理过程。原癌基因和抑癌基因亦是一些miRNA的作用靶点，当这些miRNA出现异常时将导致原癌基因被激活、抑癌基因失活，从而导致癌症的发生^[24]。

BOUTABB等^[25]研究显示，未经治疗的肺癌病人循环miR-16-5p、miR-92a-3p和miR-451a水平显著高于健康个体，接受化疗的病人miR-16-5p和miR-451a表达水平较未化疗病人显著降低，表明miRNA可能在肺癌发生发展的关键通路中发挥调控作用。XI等^[26]的研究表明，外周血miR-146a、miR-200b、miR-7水平在肺结节和NSCLC病人体内有明显差异。另有一项研究发现，合并肺癌的COPD病人在诊断肺癌的前3年，其血清中的miR-1246和miR-206就存在显著差异表达，说明miRNA可以用于肺癌的诊断及早期筛查^[27]。

miRNA的分离提取和检测过程尚无规范化程序，且当前研究范围较局限，欲准确衡量其临床价值还需大规模的临床试验验证。

2.5 TEP

TEP是新近兴起的肿瘤生物标志物，由肿瘤细胞将肿瘤相关分子转移到血小板上，改变其RNA和蛋白质而产生^[28]，最早由BEST等^[29]于2015年发现。

BEST等^[29]分析肺癌病人和健康者的血小板mRNA谱，发现其识别肺癌病人的灵敏度和特异度分别达到了97.0%、94.0%，准确度为96.0%。另有一项研究结果显示，NSCLC病人血小板整合素亚基α2b(ITGA2B)水平明显高于健康者，在队列研究中诊断Ⅰ期NSCLC的灵敏度和特异度分别为96.4%和78.6%^[30]。

TEP在外周血中含量高、能富集肿瘤细胞RNA以反映肿瘤生物学信息，但其作用机制、应用价值等方面的研究均处于起步阶段，未来仍需要大量前瞻性研究来验证其应用可行性。

2.6 DNA甲基化

DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下将甲基基团添加到DNA分子碱基上，最常见胞嘧啶第5位碳原子与甲基的结合。DNA分子中某些区域有较高密度的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)，称之为CpG岛(CGIs)，这些区域在正常情况下保持未甲基化状态，而在恶性肿瘤病人体内常可以观察到抑癌基因启动子CGIs的高甲基化。异常的DNA甲基化会导致染色体结构改变、旋转增加，影响基因转录，可能导致肿瘤的发生。

一项研究结合临床资料、影像和基于基因甲基化的PulmoSeek模型构建PulmoSeek Plus模型，其在早期肺癌(0期和Ⅰ期)和5~10 mm结节中的诊断灵敏度分别为98.0%和99.0%，应用该模型对肺结节进行分类，可减少89.0%非必要手术并使延迟治疗降低73.0%^[31]。

DNA甲基化通过PCR扩增更易检出，且它可能是一种癌前改变，有益于在更早期发现病变^[32]。但和其他生物标志物一样，其临床应用也需要更多大样本研究的支持，实际应用于临床仍有很长的路要走。

2.7 肿瘤相关自身抗体

肿瘤细胞发生基因突变、重组，从而产生异常蛋白，连同肿瘤细胞死亡后释放出的细胞内蛋白，共同称为肿瘤相关自身抗原，它可以激活机体的免疫系统，诱发产生肿瘤相关自身抗体^[33]。

由英国Oncimmune公司研发的EarlyCDT-Lung肺癌相关自身抗体谱在欧美得到了推广^[34]。另外，经一项大规模、多中心研究验证，我国针对亚洲人群基因特点研发的7种自身抗体检测也在肺癌的早期诊断中表现出了很好的诊断效能，该自身抗体谱对Ⅰ期、Ⅱ期NSCLC病人和局限性小细胞肺癌病人的诊断灵敏度分别达到62.0%、59.0%和59.0%^[35]。

2.8 循环染色体异常细胞(CAC)

肿瘤细胞在复制的过程中常会发生染色体结构的异常，从而产生CAC。携带3号(3p22.1，3q29)、10号(10q22.3，CEP10)染色体突变的外周血单个核细胞被命名为CAC，2010年首次在NSCLC病人外周血中被检测到，据报道，CAC与原发肿瘤中的基因异常相似，与早期肺癌密切相关，且这些细胞的检测不依赖于EpCAM，因此克服了CTC检测的局限性^[36]。

2020年KATZ等^[37]公布了CAC在良恶性肺结节鉴别方面的研究成果，与组织活检结果对照，CAC诊断的整体灵敏度为88.8%，特异度达100.0%。此外，YE等^[38]进行了前瞻性研究，检测肺结节大小≤10 mm病人体内的CAC，结果显示其鉴别良恶性肺结节的灵敏度和特异度分别为70.5%和86.4%。

CAC作为液体活检领域中的一种新选择，对于肺结节良恶性鉴别、肺癌早期诊断的价值已得到了初步的研究验证，现已部分应用于临床，但尚未达到广泛临床应用要求，随着分离富集与检测技术的不断进展，CAC的实践应用价值有望得到进一步提高。

以上各类生物标记物对早期肺癌的诊断效能见表 2。

3 液体活检的检测方法

当前，ctDNA是临床应用最广泛的液体活检生物标志物，常用的检测方法包括基于PCR的靶向检测和以NGS为主的非靶向检测。PCR技术原理是先对目标DNA片段进行扩增，再进行检测，操作简便，但只能检测部分已知可疑肿瘤基因片段。相比之下，NGS对所需DNA样本的纯度和浓度要求更低，能同时检测多个突变基因位点并对其进行深度测序^[41]，灵敏度和准确性都有显著提高。吕爽等^[42]对比分析了NSCLC病人病理组织切片DNA检测结果和NGS对其外周血ctDNA的检测结果，发现两种方法无显著差异，证明NGS检测ctDNA突变具有较高的准确性。

4 液体活检与人工智能(AI)辅助诊断联合应用

目前，AI越来越广泛地应用于医疗领域，在肿瘤的早筛早诊方面，液体活检与AI技术的联合为实现精准医疗、提高诊断效率及准确性提供了新的方向。

首先，经典机器学习、深度学习、影像组学等AI技术较人力能够更高效、自动化地获取影像学的深层图像信息，与液体活检的联合应用对于肺结节的检出及良恶性鉴别意义较大。梁文华等^[43]联合AI分析CT影像与ctDNA甲基化检测鉴别肺结节良恶性，将检测模型的准确率提高到了91.0%；YE等^[44]综合临床特征、肺结节影像学特征、AI分析LDCT数据及液体活检建立了一个早期肺癌预测模型，其灵敏度和特异度分别为89.5%和81.3%，AUC为0.88。

此外，将人工智能与液体活检NGS相结合也为肺癌的早期诊断开辟了新的可能。首先通过NGS获得肺癌病人的基因组信息，绘制基因组图谱，再利用机器学习对其基因组信息进行分析，构建算法模型以用于肺癌的早期诊断^[45]。已有研究对104例NSCLC病人的ctDNA特征谱和56例高风险病人的基因谱进行深度学习，开发了对肺癌诊断效率达50.0%~70.0%的Lung-CLiP模型^[46]。

5 液体活检在早期肺癌诊断中的优势与挑战

液体活检作为早期肺癌诊断的方法之一，因其安全、无创、便捷、可动态监测的特点逐渐改变着传统的诊治模式。传统组织活检存在一定缺陷，如局部取样所得样本相对有限，且受到病灶大小及位置的影响，尤其是对于直径小于10 mm的肺小结节及位于肺野中带、内带肺结节穿刺难度大、准确率低。另外，穿刺活检作为一种侵入性检查，面临着气胸、出血和咯血、胸膜反应、空气栓塞等并发症的问题，在安全性及病人依从性方面较液体活检有所不足。根据目前国内外研究进展，尚无影像学联合组织活检与液体活检两种检测技术在肺结节诊断方面的比较研究，未来开展该领域的临床研究将能够对该两种检测技术的诊断效能做出更加客观的对比。

然而，液体活检仍不可取代组织活检的诊断金标准价值，且其检测的灵敏度和特异度有待进一步提高，亟需更加灵敏、准确的检测技术以及标准的技术规范，以提高肺癌诊断的准确性、规范性及可推广普及性。

6 总结与展望

实现肺癌的早筛早诊对提高病人生存率、指导针对性药物应用或外科治疗、改善病人预后等意义重大。液体活检为早期肺癌的诊断提供了新选择，其与影像学、AI技术等相结合更是一种前景巨大的诊断模式。

作为早期肺癌诊断领域的研究热点，液体活检技术近年来发展迅猛，随着检测技术的不断更新、检测程序逐渐规范化，结合基础研究的理论支持及更多的临床研究进行验证，液体活检技术必能在早期肺癌的精确诊断、治疗指导、预后判断等方面实现其应用价值。