2024, Vol. 60
阿尔茨海默病(AD)是一种常见的神经退行性疾病，是痴呆症的主要原因。据世界卫生组织发布的报告，到2050年痴呆症的患病率将在全球范围内翻3倍，将成为本世纪最昂贵、最致命和负担最重的疾病之一[1]。AD的病理特征主要包括由异常过度磷酸化的Tau蛋白形成的细胞内神经原纤维缠结和以β-淀粉样蛋白(Aβ)为主要成分的细胞外神经炎性包块[2]。但是，迄今为止，该病的发病机制并未被完全阐明。目前已知内质网应激(ER)在AD发病的过程中起着至关重要的作用，而激活转录因子6(ATF-6)是ER的关键传感器[3]。既往研究表明，ATF-6蛋白表达增加可通过自噬诱导神经保护作用，利于AD小鼠记忆的恢复[4]。AA147是一种内质网蛋白稳态调节剂，可通过选择性激活未折叠蛋白反应ATF-6的臂对神经元细胞氧化损伤起到保护作用。目前尚未有研究揭示能否通过AA147激活ATF-6从而对AD起到保护作用。本研究通过构建Aβ1-42诱导的AD细胞模型，探讨激活ATF-6对AD的保护作用，从而为开发有效的AD治疗策略提供实验依据。
1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验动物孕17~19 d的健康成年雌性SD大鼠，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，饲养于青岛大学医学部实验动物中心。本实验经青岛大学动物伦理委员会批准。
1.1.2 实验试剂AA147粉末购自美国MCE公司，将AA147粉末5 mg溶于1.9 mL的二甲基亚砜(DMSO)溶液中制备10 mmol/L的母液；ATF-6抗体、Neurobasl Medium培养液购自Abcam抗体公司；Akt与p-Akt抗体购自CST公司；Map2抗体、多聚赖氨酸(PDL)、DMSO、六氟异丙醇(HFIP)购自sigma公司；β-actin、兔二抗、鼠二抗购自武汉三鹰生物技术公司；羊抗鼠IgG-AlexaFluor-488、羊抗兔IgG-AlexaFluor-555、增强型CCK-8试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司；Aβ1-42购自上海吉尔生化有限公司；B-27 supplement(50×)、青霉素-链霉素(100×)、2.5 g/L胰蛋白酶溶液、胎牛血清、谷氨酰胺Glutamax均购自Gibico公司；磷酸盐缓冲液、D-Hanks溶液、DMEM高糖培养液均购自北京索莱宝科技有限公司；ECL发光液购自美国Milipore公司。
1.2 实验方法 1.2.1 原代神经元的培养选择1只孕17~19 d的SD大鼠，引颈处死，在无菌环境中取出胎鼠并将其置于提前准备好的无菌培养皿中，显微镜下剥离胎鼠大脑皮质，置于含DMEM高糖培养液的离心管中，全部剥离结束后，将离心管置于离心机中，以1 000 r/min离心5 min，取出离心管，弃掉上清，保留管底的脑组织，每管加入0.5 g/L的胰蛋白酶溶液1.5 mL，吹打均匀后置于37 ℃的细胞培养箱消化25 min，消化结束后，按照1∶1的比例加入含体积分数0.10胎牛血清的DMEM细胞培养液终止消化。混合液经0.2 μm的无菌过滤器过滤，置于离心管中，然后以1 000 r/min离心10 min，弃掉上清及未消化的团块，加入神经元培养液，反复吹打，待细胞均匀悬浮后进行计数。最后将细胞接种于提前6 h用稀释的PDL包被过的6孔板中培养，1 d后全换液，后每3 d半量换液1次，培养至第13天，用于后续实验。神经元培养液按照Neurobasl Me-dium∶B-27 supplement(50×)∶青霉素-链霉素双抗(100×)∶谷氨酰胺Glutamax(100×)=100∶2∶1∶1的比例配制。
1.2.2 AD细胞模型的制备① Aβ1-42寡聚体制备：取1 mg Aβ1-42单体粉末和六氟异丙醇(HFIP)置于冰上预冷，向装有1 mg Aβ1-42单体粉末的EP管中加入HFIP 222 μL，密封，涡旋混匀，室温孵育60 min，直到液体澄清，即可得到1 mmol/L的Aβ-HFIP溶液。再将Aβ-HFIP溶液放回冰上5 min。取4只无菌EP管，分装Aβ-HFIP溶液各55 μL，在通风橱中挥干HFIP，得到无色透明Aβ肽膜，置于-20 ℃冰箱保存。使用前取一支分装好的EP管，在冰盒上进行操作，加入DMSO 11 μL，水浴超声(300 W，35 Hz)处理10 min，然后加入PBS溶液539 μL，涡旋混匀，将其置于4 ℃冰箱孵育1 d。孵育结束之后，将EP管置于离心机中，在4 ℃条件下以1 000 r/min离心10 min，取上清液，即可得到100 μmol/L的Aβ寡聚体[5]。②AD细胞模型制备：将2 μmol/L的Aβ1-42寡聚体加入神经元培养液中诱导24 h，即可得到AD细胞模型。
1.2.3 实验分组及处理以培养至13 d的神经元作为实验对象，选取6孔板中神经元密度、状态相似的4个孔的神经元，随机分为对照组(A组)、Aβ1- 42处理组(B组)、Aβ1-42+DMSO组(C组)、Aβ1- 42+AA147组(D组)。对照组加入10 μmol/L的DMSO溶液处理神经元12 h；Aβ1-42组加入2 μmol/L Aβ1-42寡聚体诱导皮质神经元24 h；Aβ1-42+DMSO组先加入10 μmol/L的DMSO预处理神经元12 h，后继续加入2 μmol/L Aβ1-42寡聚体诱导皮质神经元24 h；Aβ1-42+AA147组先加入10 μmol/L的AA147预处理皮质神经元12 h，后继续加入2 μmol/L的Aβ1-42寡聚体诱导皮质神经元24 h。
1.2.4 CCK-8比色法检测皮质神经元存活率将各组神经元处理后，更换新的神经元培养液，加入CCK-8试剂(每100 μL神经元培养液加入CCK-8试剂10 μL)，在37 ℃培养箱中避光孵育4 h，用酶标仪检测450 nm处的吸光度(A)值，计算细胞活力，以其表示神经元存活率。细胞活力(%)=(处理组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)×100%。
1.2.5 免疫荧光染色检测神经元存活将装有爬片的24孔培养板中的神经元培养至13 d时，按照1.2.3方法分组及处理后，用PBS溶液在水平摇床上洗5 min；然后每孔加入40 g/L的组织固定液1 mL固定20 min，再用PBS洗3次，每次10 min；其后以含体积分数0.003的Triton-100溶液破膜10 min，以5 g/L牛血清清蛋白封闭液封闭1 h，加入神经元细胞骨架特异性标记蛋白Map-2抗体(1∶500)4 ℃孵育过夜；然后用PBS洗3次，每次10 min；加二抗山羊抗体IgG抗体(1∶500)在室温下避光孵育1 h；用PBS洗3次，每次10 min，最后用含DAPI染料的抗荧光衰减封片剂封片。荧光显微镜下采集图像，观察神经元的形态及数量，确定神经元的存活情况。
1.2.6 Western blot方法检测ATF-6、p-Akt蛋白的表达将4组细胞经相应处理后，弃掉每个孔中的细胞培养液，用PBS溶液清洗3次，每次5 min；然后加入蛋白提取裂解液，消化裂解10 min；应用200 μL的移液枪枪头均匀地将贴在孔板底部的细胞刮下来置于EP管中，4 ℃下以12 000 r/min离心15 min，取上清液置于另一EP管中。采用BCA法测定蛋白浓度，用裂解液和上样缓冲液配平，在100 ℃金属浴锅中变性10 min，冷却后分装-80 ℃保存。配制100 g/L的10孔SDS聚丙烯酰胺凝胶，每孔取15 μg蛋白样品上样，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以300 mA、90 min转印至硝酸纤维素(PVDF)膜上，膜用含有50 g/L脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭2 h；加一抗ATF-6(1∶1 000)、Akt(1∶2 000)、p-Akt(1∶2 000)、β-actin(1∶4 000)，4 ℃孵育过夜；次日以TBST溶液洗涤3次，每次10 min；再加入相应二抗室温孵育1 h，以TBST溶液重复洗涤3次；用ECL发光液显影。以β-actin为内参，Image J软件分析蛋白条带灰度值，以目的蛋白的灰度值/内参蛋白的灰度值表示目的蛋白相对表达量。
1.3 统计学处理应用GraphPad Prism 9.0软件进行统计学分析。计量资料数据以x ± s表示，多组数据比较采用单因素方差分析(ANOVA)，两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组神经元存活率比较CCK-8检测显示，各组神经元存活率差异有统计学意义(F=47.42，P < 0.01)，其中Aβ1-42组细胞存活率较对照组明显降低(t=9.42，P < 0.05)，Aβ1-42+AA147组细胞存活率较Aβ1-42组升高(t=5.73，P < 0.05)，Aβ1-42+DMSO组细胞存活率与Aβ1-42组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表 1。免疫荧光染色结果进一步证实，与对照组相比，Aβ1-42组神经元的存活数量降低，Aβ1-42+AA147组较Aβ1-42组神经元的存活数量显著增多，Aβ1-42+DMSO组神经元的数量与Aβ1-42组比较无明显差异(图 1)。AA147处理提高了Aβ1-42损伤后神经元存活数量。
| 表 1 各组神经元存活率、ATF-6及p-Akt蛋白表达比较(x ± s) |
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| DAPI：细胞核标记；Map2：神经元细胞骨架特异性标记物；Merge：细胞核与神经元细胞骨架合并。标尺为120 μm。 图 1 各组神经元免疫荧光染色观察 |
Western blot检测显示，各组ER相关通路蛋白ATF-6及其下游信号蛋白p-Akt表达差异有统计学意义(F=11.77、26.10，P < 0.05)。其中Aβ1-42组ATF-6及p-Akt蛋白表达明显低于对照组，Aβ1-42+AA147组高于Aβ1-42组，差异有统计学意义(P < 0.05)；Aβ1-42+DMSO组ATF-6及p-Akt蛋白表达与Aβ1-42组比较差异无显著性(P>0.05)。见图 2、表 1。
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| A：对照组；B：Aβ1-42组；C：Aβ1-42+DMSO组；D：Aβ1-42+AA147组。 图 2 各组神经元中ATF-6及p-Akt表达的Western blot检测 |
控制神经元功能和存活的信号通路异常是引起包括AD和帕金森病(PD)在内的神经退行性疾病的重要机制[6-7]。从理论上讲，人类大脑神经元可以存活100年并且能够执行正常的生理功能，但是在实际中代谢缺陷、氧化应激、大脑损伤等原因会诱导大脑中神经元损伤、退化和丢失。AD是一种进行性神经退行性疾病，在老年人口中的患病率不断上升，其主要症状为不可逆性的近期记忆丧失、认知功能障碍和行为功能的逐渐下降。由Aβ异常沉积形成的细胞外神经炎性斑块是AD重要的病理机制之一[8-10]。相关研究结果表明，在AD病人中，当Aβ的转运与清除发生障碍时，会诱发ER反应，引起神经元的凋亡; 而适应性上调未折叠蛋白反应(UPR)信号可以逆转ER的应激并且恢复ER稳态，从而防止AD中神经细胞的丢失[3]。因此，激活UPR信号通路可能对减轻AD病人的神经元丢失具有重要的意义。
UPR信号主要由IRE1、ATF-6和PERK为主导的3个信号通路组成，当其中任一通路被激活，这些蛋白质就会启动转录和翻译信号以减轻ER的压力、减少细胞的死亡[6]。有研究表明，当UPR信号中ATF-6蛋白表达下降时，将导致神经退行性疾病、蛋白质错误折叠疾病、糖尿病、缺血性疾病和癌症[12-18]，提示建立选择性调节ATF-6信号可能改善与该信号失衡相关的疾病。此外，在缺血性脑卒中，在脑缺血发生前激活ATF-6信号可能对脑缺血再灌注损伤具有一定的保护作用[19]。有研究表明，与正常人相比，AD病人的大脑中ATF-6蛋白表达水平明显降低[4]。提示激活UPR信号通路中ATF-6信号可能会对AD起到神经保护作用。AA147为一种小分子化合物，为ATF-6的靶向药物激活剂，其可通过选择性激活UPR信号中ATF-6信号来增强内质网蛋白稳态，减少不稳定且易于聚集的蛋白质的分泌[20]。有研究表明，AA147可以通过上调ATF-6蛋白表达对心肌梗死、心脏骤停起到一定的保护作用[19, 21-22]；在心肌缺血再灌注损伤中，ATF-6/p-Akt信号通路的激活对神经细胞起着关键的保护作用[23-24]。推测AA147可能通过激活ATF-6/p-Akt信号通路对AD起到神经保护作用。本文研究结果显示，在Aβ1-42诱导的AD细胞模型中神经元的存活率降低，ATF-6及p-Akt蛋白表达均显著降低; 而AD细胞模型给予AA147处理后，神经元的存活率显著升高，同时ATF-6和p-Akt蛋白的表达上调，提示AA147处理能够对AD细胞模型中神经元的存活起到保护作用。
综上所述，AA147对Aβ1-42诱导的AD细胞模型具有保护作用，AA147通过上调ATF-6蛋白表达激活Akt信号通路起到神经保护作用。本文结果可为开发有效的AD治疗策略提供实验依据。但p-Akt如何通过下游信号发挥神经保护作用仍然未知，需要进一步研究。
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