骨关节炎(OA)是以关节软骨变性为特征的关节炎性疾病^[1]。NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎症小体是存在于细胞内的由感受分子NLRP3、接头分子凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和效应分子半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1(caspase-1)组成的多蛋白复合体^[2]。既往研究证实，NLRP3炎症小体可参与多种慢性炎症疾病，如阿尔茨海默病^[3-4]、动脉粥样硬化^[5-6]和2型糖尿病^[7]等，但该小体是否参与OA关节软骨炎症尚未明确。本研究采用逆转录实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)、蛋白质印迹法(Western blot)以及酶联免疫吸附测定(ELISA)等方法检测OA关节软骨中NLRP3炎症小体的表达，探讨其在OA发生发展过程中的作用，为OA的综合防治提供理论支持。

1 材料与方法 1.1 临床标本

本研究经青岛大学附属医院伦理委员会批准，病人及家属均签署知情同意书。OA组软骨组织取自2018年1—12月于青岛大学附属医院接受全膝关节置换术的OA病人。OA组病人均排除类风湿性关节炎和痛风性关节炎，术前X线检查均符合Kellgren-Lawrence分级Ⅲ级，其中男12例，女18例，年龄62~86岁，平均(67.59±6.31)岁。对照组软骨组织取自2018年1—12月就诊于青岛大学附属医院因创伤接受下肢截肢术的病人。对照组病人均无膝关节疾病史，术前X线检查符合Kellgren-Lawrence分级Ⅰ级，其中男6例，女4例，年龄25~48岁，平均(35.16±8.47)岁。

1.2 实验试剂及仪器

RNAiso、反转录试剂盒及荧光定量试剂盒购自北京Takara公司，兔抗人NLRP3、ASC及caspase-1一抗购自英国Abcam公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗、兔抗人β-actin一抗、人白细胞介素1β(IL-1β)ELISA检测试剂盒均购自武汉Elabscience公司，RNA引物由北京睿博兴科生物技术公司合成，Light Cycler 480 PCR扩增仪购自瑞士罗氏公司。

1.3 软骨组织的鉴定

取人OA软骨和正常软骨组织，以40 g/L多聚甲醛固定后，采用梯度乙醇脱水、二甲苯透明，接着浸入已熔化的石蜡中进行包埋。将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成5~8 μm薄片，贴到载玻片上，放入45 ℃恒温箱中烘干。行苏木精-伊红染色观察、鉴定软骨组织。

1.4 总RNA提取及RT-qPCR

将OA组和对照组软骨组织于液氮中研磨成粉状，按每50 mg组织加入2 mL RNAiso试剂裂解，经氯仿抽提、异丙醇沉淀、体积分数0.75乙醇洗涤后加适量无酶水溶解，用分光光度计测定总RNA的浓度及纯度。按照反转录试剂盒说明书将1 μg RNA反转录为互补DNA，应用荧光定量试剂盒进行荧光定量PCR，以GAPDH作为内参照，采用2^-△△Ct方法计算基因相对表达量。RT-qPCR各引物序列见表 1。

1.5 总蛋白提取及Western blot

将OA组和对照组软骨组织于液氮中研磨成粉状，按每20 mg组织加入100 μL RIPA裂解液于冰上裂解30 min，以12 000 r/min离心后取上清，用BCA法测定总蛋白浓度。取50 μg总蛋白加入上样孔进行SDS-PAGE凝胶电泳，恒定电流条件下将蛋白转移至PVDF膜上，用50 g/L脱脂奶粉封闭1 h。分别加入兔抗人NLRP3、ASC、caspase-1及β-actin一抗(1∶1 000稀释)，4 ℃过夜孵育。加入HRP标记的羊抗兔二抗(1∶2 000稀释)，37 ℃孵育1 h，以TBST洗涤3次，加入ECL显影液后成像，用Image J行灰度值扫描，以目的条带和对应β-actin条带灰度值之比作为蛋白相对表达量。

1.6 ELISA检测软骨组织IL-1β含量

将OA组和对照组软骨组织于液氮中研磨成粉状，按1 g软骨组织加入9 mL PBS进行反复冻融，离心取上清。按照试剂盒说明书，依次加入标准品或样品、生物素化抗体工作液、酶结合工作液、底物工作液和终止液，用酶标仪测定450 nm波长下的光密度(OD)值，绘制标准曲线，依据样本OD值计算浓度。

1.7 统计学分析

应用SPSS 23.0软件进行统计学分析，利用Graphpad Prism 8.0软件作图。定量变量以x±s表示，两组比较采用t检验，P < 0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 软骨组织鉴定

OA软骨组织中软骨细胞变性、坏死、数量减少、排列紊乱，部分可聚集成簇，基质染色不均存在异染性。对照软骨组织中软骨细胞数目正常、排列整齐，基质染色均匀无异染性。

2.2 两组NLRP3炎症小体及IL-1β mRNA表达比较

与对照组相比较，OA组软骨组织内NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β mRNA表达量显著升高，差异具有统计学意义(t=4.042~6.566，P < 0.001)。见表 2。

2.3 两组NLRP3炎症小体及IL-1β蛋白表达比较

与对照组相比较，OA组软骨组织内NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β蛋白表达量显著升高，差异具有统计学意义(t=5.090~6.704，P < 0.001)。见表 3。

3 讨论

OA是以关节疼痛、活动受限、关节畸形为临床表现的关节退行性疾病^[8]。OA好发于中老年病人，在我国65岁以上的人群OA患病率为50%，其中症状性膝关节OA的患病率达8.1%。OA的分布具有明显的性别差异和地区差异，女性高于男性，农村高于城市^[9-10]。OA与多种危险因素相关，如年龄、炎症、劳损、创伤与肥胖等，但目前其具体发病机制仍不甚清楚^{[1, 11-12]}。探究OA发病的分子机制，为OA的综合防治提供合适的靶点是当前OA研究领域的热点。

既往研究认为OA是一种非炎症性疾病，主要受机械应力的调控^[13-14]。然而越来越多的研究证实，炎症是影响OA进展的关键因素。OA病人血清及关节液中IL-1β、肿瘤坏死因子α及IL-6等炎症因子表达升高，进一步研究发现，整个滑膜关节(包括关节软骨、软骨下骨、滑膜组织、韧带和半月板)均参与炎症因子的调控^[15-17]。OA病人关节中一方面存在炎症因子的表达升高，另一方面相关炎症因子受体如IL-1β受体表达上调，软骨细胞对炎症因子的敏感性增强^[18]。软骨细胞外基质(ECM)主要包括Ⅱ型胶原和蛋白多糖，正常情况下存在合成代谢与分解代谢的动态平衡。当IL-1β显著升高时可通过ERK1/2激活刺激软骨细胞分泌多种基质金属蛋白酶(MMPs)以及减少Ⅱ型胶原和蛋白多糖分泌，使得ECM的动态平衡被打破^[19]。同时IL-1β可刺激软骨细胞产生过量活性氧自由基^[20]，后者可通过线粒体损伤和内质网应激等多条途径介导软骨细胞凋亡，加速OA软骨变性^[21-22]。

NLRP3炎症小体参与多种炎性疾病，其活化分为两步。第一步是启动阶段，NLRP3和炎症因子IL-1β基因的转录增加；第二步是激活阶段，表达增多的NLRP3和ASC以及caspase-1组装为炎症小体，将pro-IL-1β剪切至活性形式IL-1β，诱发炎症级联反应^[23-24]。本研究利用RT-qPCR、Western blot、ELISA等方法进行检测，在mRNA和蛋白水平比较OA软骨组织和正常软骨组织中NLRP3炎症小体组分NLRP3、ASC、caspase-1及炎症因子IL-1β的表达。结果显示，相比于正常软骨组织，OA软骨组织中NLRP3炎症小体组分的表达升高，这提示NLRP3炎症小体可能在促进关节软骨的炎症方面具有重要意义。NLRP3、ASC、caspase-1的表达相较于正常软骨升高，提示NLRP3炎症小体的活化。活化的caspase-1将pro-IL-1β剪切为IL-1β，进而导致OA关节软骨炎症的发生^[25-26]。

综上所述，本研究证实，OA关节软骨组织中NLRP3炎症小体组分及IL-1β的含量明显升高，这为NLRP3炎症小体在OA发生发展中的破坏作用提供了潜在的理论基础。