2022, Vol. 58
胃癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一，由于缺乏有效的治疗方法，其预后较差[1]。中国的胃癌发病率很高[2]。胃癌发生是一个复杂的生物过程，涉及多种因素、基因和分期，具有高度异质性。寻找新的、特异性的生物标志物对胃癌的诊断和治疗具有重要的临床价值，揭示关键基因在胃癌发病过程中的作用机制，可以为抗肿瘤实验奠定基础，为胃癌治疗提供新的选择。双糖链蛋白多糖(BGN)基因是编码富含亮氨酸的小分子蛋白多糖家族的成员[3]。BGN的主要功能包括调节基质装配、细胞迁移、细胞黏附、骨骼矿化、炎症、细胞生长、自噬以及细胞凋亡等[4-6]。因此，BGN参与了多种生理和病理生理过程，包括肿瘤发生[7]。BGN在肿瘤发生中的作用目前尚存在争议。有研究发现，在结直肠癌细胞中，BGN过表达参与了血管内皮生长因子受体信号的激活和细胞外信号激酶途径的调节，促进肿瘤的发生[8]。但是在膀胱癌中，BGN基因沉默导致肿瘤细胞增殖增强，表明BGN在该疾病中起肿瘤抑制作用[9]。目前，BGN对胃癌发生发展作用的相关研究较少。因此，本研究利用相关数据库分析BGN在胃癌中的表达及与预后的相关性，以期更好地理解BGN在胃癌发生发展中的作用，从而促进新治疗方法的开发。
1 资料与方法 1.1 数据检索及筛选本研究从Oncomine肿瘤信息数据库(https://www.oncomine.org/)中检索BGN相关数据，根据以下检索条件进行筛选：①基因名称为BGN；②癌症类型为Gastric cancer；③数据类型为mRNA；④分析对照类型为Cancer vs Normal Analysis；⑤临界值设定条件为P value＜0.05，fold change(FC)＞2，gene rank=top 10%。
1.2 BNG基因表达验证利用GEPIA2数据库(http://gepia2.cancer-pku.cn)的TCGA数据集和GETX数据集对BGN基因在肿瘤组织中的表达进行验证。设置筛选条件如下: ①gene为BGN; ②methods为ANOVA；③|Log2FC| Cutoff为2；④q value Cutoff为0.01；⑤Matched Normal data为Match TCGA normal data，Match TCGA normal and GTEX data；⑥Tissue为STAD。
1.3 基因功能富集分析收集了408例胃癌组织和36例正常胃组织的基因表达数据，这些数据来自癌症基因组图谱网站TCGA(https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga)。为研究胃癌中BGN表达相关的分子通路，采用基因集富集分析(GSEA)桌面软件进行GSEA，获得相关性排前3位的通路(P value＜0.05)。
1.4 预后分析从TCGA官方网站胃癌项目中获得基因表达数据(胃癌组织与正常胃组织)和临床信息，剔除临床信息不够完整的数据。对于最终保留的病人数据，使用sangerbox进行生存曲线绘制。总生存期(OS)定义：诊断日期至死亡日期之间的时间[10]。无疾病间隔(PFI)定义：胃癌手术至检测到复发之间的时间[11]。疾病特异性生存期(DSS)定义：结局指标为癌症相关死亡，它与癌症生物学和治疗效果有更大的关系[12]。
1.5 统计学方法采用SPSS 24.0软件进行统计分析。Kaplan-Meier模型分析用于检验BGN与胃癌预后的相关性。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 不同肿瘤中BGN的表达情况对Oncomine数据库进行检索，并分析BGN基因在肿瘤与正常组织中的差异表达情况。共检索到相关研究421项，其中BGN基因在肿瘤组织中呈高表达的研究103项，呈低表达的研究9项。对检索的结果进行筛选，在涉及胃癌的相关研究中，BGN基因在胃癌组织中呈高表达的研究11项，呈低表达的研究0项。见图 1。
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| 红色为高表达，蓝色为低表达，颜色越深表示越显著。 图 1 不同肿瘤中BGN的表达情况 |
对Oncomine数据库检索结果分析显示，BGN基因在胃癌组织及癌旁组织中存在表达差异的研究共5项(共有12个芯片数据集，包含298例组织样本)。将此12个数据集相关研究进行meta分析，结果显示，BGN在所有差异表达基因中的中位数值排名为70.5(P＜0.001)，提示该基因在胃癌组织中显著高表达。见图 2。
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| 图 2 12个数据集BGN表达与胃癌相关研究的meta分析 |
在Oncomine数据库中检索不同病理类型胃癌BGN表达的研究，对研究结果分析显示，与正常胃组织相比较，BGN基因在胃肠型胃癌(t=18.317，P＜0.001)、弥漫型胃癌(t=23.103，P＜0.001)和大细胞型胃癌(t=8.406，P＜0.001)组织中均呈显著高表达(图 3A~C)。利用GEPIA2数据库，对从TCGA和GETX数据库中筛选的胃癌组织与正常组织样本的研究结果(筛选条件为|Log2FC|＞1, P＜0.01)进行验证，结果显示，与211例正常组织样本比较，BGN在408例胃癌组织样本中也呈现高表达(图 3D)。
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| A：胃肠型胃癌组织与正常胃组织BGN表达的比较；B：弥漫型胃癌组织与正常胃组织BGN表达的比较；C：大细胞型胃癌组织与正常胃组织BGN表达的比较；D：TCGA、TCGA+GETX数据库中胃癌组织与正常胃组织BGN表达的比较。与正常胃组织比较，*P＜0.01。 图 3 BGN在不同病理类型胃癌中的表达 |
为了确定胃癌中可能的BGN相关通路，使用TCGA胃癌数据集的数据进行GSEA，结果显示，BGN在胃癌中的表达可能与同种异体排斥、顶端连接、凋亡信号通路密切相关。见图 4。
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| 图 4 胃癌中BGN基因功能的GSEA富集图 |
自TCGA数据库中下载胃癌病人相关临床数据进行分析。根据临床结局情况，分别进行筛选。分别对441例病人的OS结局、420例病人的DSS结局及435例病人的PFI结局进行Kaplan-Meier Plotter分析，以比较BGN表达与胃癌病人不同预后结局间相关性。结果显示，BGN表达水平与胃癌病人OS、DSS、PFI均呈显著负相关(P=0.002~0.039)，BGN高表达病人的OS、DSS和PFI均明显短于BGN低表达病人。见图 5。
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| A：BGN表达与OS的相关性；B：BGN表达与DSS的相关性；C：BGN表达与PFI的相关性。 图 5 BGN表达与胃癌病人预后的关系 |
胃癌是一种常见的恶性肿瘤，是世界范围内因肿瘤死亡的主要原因。目前外科手术是治疗胃癌的主要手段，但手术治疗具有较高的复发率。靶向治疗是治疗癌症的新策略与新方法，但是目前胃癌仍缺乏有效的靶向治疗。所以，寻找潜在的胃癌相关基因有助于胃癌的治疗与预后判断。同时，炎症和肿瘤发展之间的关系被越来越多的证据证实。虽然炎症在组织损伤修复与对抗病原体中有着重要作用，但是如果炎症消退不及时会使得免疫细胞浸润，伴随产生大量的免疫细胞因子、趋化因子等，这些免疫因子会引起组织的再次损伤与炎性反应，改变免疫微环境，从而在一定程度上促进肿瘤的发生发展。
BGN基因与炎症密切相关，可能作为肿瘤发生发展的重要因子参与癌症的进程。有研究显示，BGN在人类胰腺癌、卵巢癌、结肠癌等肿瘤组织中均存在过表达[13-15]。本文结果显示，BGN的表达与同种异体排斥、顶端连接、凋亡信号通路密切相关。细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。已有研究表明，BGN与肿瘤细胞凋亡密切相关，BGN的缺失通过细胞凋亡促进细胞死亡，BGN的表达干扰胃癌病人抗凋亡和促凋亡基因的调节，提示BGN参与的细胞凋亡途径可能是治疗胃癌的一个靶点[16-17]。关于同种异体排斥、顶端连接相关的信号通路对癌症作用的研究较少，推测BNG可能通过参与这些通路，直接或间接地参与胃癌的发生发展，但这种猜想需要进一步的研究证明。既往有研究结果显示，BGN可通过TLR2/4-NF-κB和P2X7-NLRP3-caspase-1信号通路直接参与肿瘤的调控，同时可以通过下游递质，如活性氧(ROS)、血管内皮生长因子(VEGF)间接影响肿瘤的发生发展进程[18]。
慢性炎症在胃癌的进展和转移中起着至关重要的作用[19]。慢性胃炎已被证明是胃癌的关键病因，控制胃部炎性反应被认为是临床预防胃癌发生的有效方法，但胃部炎症导致胃癌的机制还需要进一步探索。ROS、VEGF主要参与炎症介导的损伤，多数研究发现胃癌组织中ROS、VEGF的含量增加，表明二者参与了肿瘤的进程[20-21]。炎症反应中公认的细胞内信号通路之一是核因子κB(NF-κB)信号通路。Toll样受体(TLR)基因(特别是TLR2、TLR4和TLR10)在宿主防御中起重要作用[22]。目前研究表明，在胃癌组织中，TLR4蛋白基本呈高表达状态，且其表达可能与肿瘤恶性侵袭、转移、TNM分期密切相关[23]。NLRP3炎性小体作为目前研究较为广泛的复杂炎性体，激活后可通过活化半胱天冬酶-1，剪切白细胞介素(IL)-1β或IL-18，引起大量炎症因子的释放，IL-1β及IL-18等炎性因子的过表达在肿瘤的逐步演进过程中起着重要作用[24]。结直肠癌、乳癌等组织中NLRP3的表达水平均明显高于对应的正常组织[25]。有研究结果显示，NF-κB蛋白在胃癌组织中的阳性染色率(71.43%)明显高于癌旁正常切缘(23.81%)，NLRP3的阳性染色率(78.57%)也显著高于癌旁正常切缘(16.67%)[26]。BGN基因通过参与调控TLR2/4-NF-κB和P2X7-NLRP3-caspase-1信号通路可能在胃癌的发展中起到重要作用。但胃癌中BGN与下游信号通路的关系机制较为复杂且不十分清楚，仍需通过进一步的实验研究进行探讨。
综上所述，本研究使用生物信息学的方法，基于Oncomine、GEPIA2与TCGA数据库的联合分析显示，BGN基因在胃癌组织中高表达，且与病人的OS、DSS和PFI有关。表明BGN基因参与了胃癌的重要进程，并影响其预后。检测胃癌组织中BGN的表达有助于评估病人的风险状况和预后。BGN有可能成为肿瘤治疗的新靶点，为胃癌的治疗提供新的方向。
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