结直肠癌是我国最常见的消化道恶性肿瘤之一，近30年内的发病率以平均每年3%~4%上升。我国结直肠癌发病例数占全世界发病总例数的18.6%，死亡例数占全世界死亡总例数的20.1%，均占据第1位^[1-2]。肿瘤的位置、浸润深度、淋巴结转移及大体类型是影响结直肠癌病人根治术后复发、转移的重要因素，也是判断结直肠癌病人预后情况的关键因素^[2]。已有研究结果表明，结直肠癌的发生发展与上皮-间充质转化(EMT)机制相关^[3-4]。富含AT序列的特异性结合蛋白2(SATB2)是一种核基质相关蛋白，属于SATB家族，SATB2通过与核基质附着区(MAR)相结合，激活及调控多个基因转录的过程。SATB2在大脑皮质、消化道的腺上皮细胞、骨髓及免疫系统中有较高的表达。最近有研究结果表明，SATB2不但在成骨细胞分化和中枢神经系统发育过程中起着重要的作用，而且在结直肠癌中有着高度的敏感性和特异性^[5-7]。S100钙结合蛋白P(S100P)属于S100家族成员，是一种小型的钙离子结合蛋白。S100P与多种肿瘤如胰腺癌、乳癌、前列腺癌、结直肠癌、肺癌、胃癌等相关，其蛋白的异常表达与肿瘤细胞的生长、耐药性、转移以及预后不良有关。已有研究结果表明，S100P的表达对结直肠癌的生长转移有着重要的作用^[8]。本文研究应用免疫组织化学的方法检测SATB2、S100P蛋白在结直肠癌组织中的表达，分析二者与肿瘤临床病理学特征的关系，以及与EMT相关蛋白β-连环蛋白(β-catenin)、上皮性钙黏附蛋白E(E-cadherin)之间的相关性，探讨SATB2及S100P蛋白在结直肠癌中的异常表达及其促进肿瘤浸润与转移的可能机制。现将结果报告如下。

随机选取青岛大学附属烟台毓璜顶医院手术切除、经病理检查诊断为结直肠腺癌的癌组织及其癌旁正常黏膜组织各100例。所有病人手术前均未接受放疗及化疗。100例病人中，男61例，女39例; 年龄27~82岁，平均(63.57±9.95)岁。肿瘤位于左半结肠77例，右半结肠23例; 低分化24例，中分化66例，高分化10例; 无淋巴结转移55例，1~3个淋巴结转移29例，>3个淋巴结转移16例。

小鼠抗人SATB2单克隆抗体、S100P单克隆抗体、β-catenin单克隆抗体及E-cadherin单克隆抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，DAB染色液以及其免疫组化试剂盒均为罗氏诊断产品(上海)有限公司产品。

标本经40 g/L甲醛固定，常规取材、石蜡包埋，4 μm厚连续切片6张，分别行免疫组化染色和苏木精-伊红(HE)染色，检测SATB2、S100P、β-catenin和E-cadherin的表达情况。根据试剂盒说明书进行操作。用已知阳性的切片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。

SATB2阳性表达定位于细胞核; S100P阳性表达定位于细胞浆，少量定位于细胞膜以及细胞核; E-cadherin阳性表达定位于细胞膜。以细胞膜呈不同程度的棕黄色染色为阳性染色。用二级计分法对染色结果进行判定，首先根据阳性染色细胞所占比例评分：0分，< 5%;1分，6%~25%;2分，26%~50%;3分，51%~75%;4分，>75%。再根据细胞阳性染色程度计分：0分，未着色; 1分，淡黄色; 2分，黄色; 3分，棕褐色。最后根据两者分值的乘积判断结果：阴性，< 1分; 弱阳性，2~4分; 阳性，5~8分; 强阳性，>9分。

β-catenin正常阳性表达定位于细胞膜，呈棕黄色细小颗粒状，且阳性细胞数>70%;而β-catenin的异常表达指细胞膜阳性表达缺失以及细胞质/细胞核异位阳性表达。凡出现细胞膜阳性表达减弱或缺失为异常表达，≥10%的细胞质/细胞核异位阳性表达也视为异常表达^[9]。

应用SPSS 19.0软件进行统计学处理。计数资料比较采用卡方检验，相关分析采用Spearman等级相关方法。以P < 0.05为差异有统计学意义。

结直肠癌组织SATB2、S100P、E-cadherin阳性表达率分别为90%、65%、85%，β-catenin异常表达率为46%;癌旁正常黏膜组织中SATB2、S100P、E-cadherin阳性表达率分别为98%、4%、100%，β-catenin异常表达率为0。两种组织SATB2、S100P、β-catenin、E-cadherin表达比较，差异有统计学意义(χ²=5.674~82.332，P < 0.05)。见图 1。

A：结直肠癌组织中SATB2阴性表达; B：结直肠癌组织中SATB2阳性表达; C：癌旁正常黏膜组织中SATB2阳性表达; D：结直肠癌组织中S100P阴性表达; E：结直肠癌组织中S100P阳性表达; F：癌旁正常黏膜组织中S100P阴性表达; G：结直肠癌组织中β-catenin的正常表达; H：结直肠癌组织中β-catenin的异常表达，细胞膜表达缺失; I：结直肠癌组织中β-catenin的异常表达，定位于细胞核、细胞质; J：癌旁正常黏膜组织中β-catenin的正常表达; K：结直肠癌组织中E-cadherin弱阳性表达; L：结直肠癌组织中E-cadherin阳性表达; M：结直肠癌组织中E-cadherin强阳性表达; N：癌旁正常黏膜组织中E-cadherin强阳性表达。免疫组化染色，400倍。 图 1 结直肠癌和癌旁正常黏膜组织中SATB2、S100P、β-catenin和E-cadherin表达

SATB2表达与结直肠癌病人肿瘤直径、分化程度、淋巴结转移有关(χ²=14.733~19.424，P < 0.05);与性别、年龄、肿瘤部位、浸润深度、TNM分期无关(P>0.05)。S100P表达与结直肠癌病人肿瘤分化程度、淋巴结转移有关(χ²=13.298、14.945，P < 0.05);与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤直径、浸润深度、TNM分期无关(P>0.05)。见表 1、2。

表1(Table 1)

表 1 SATB2蛋白表达与结直肠癌病人临床病理特征的关系(例)

表 1 SATB2蛋白表达与结直肠癌病人临床病理特征的关系(例) 临床病理特征 n SATB2表达 χ2 P 阴性 弱阳性 阳性 强阳性 性别   男 61 4 3 22 32   女 39 6 2 11 20 2.308 0.511 年龄(岁)    < 60 35 5 1 13 16   ≥60 65 5 4 20 36 2.173 0.537 分化程度   低分化 24 6 3 10 5   中分化 66 4 2 18 42   高分化 10 0 0 5 5 19.424 0.004 肿瘤部位   左半结肠 77 6 4 25 42   右半结肠 23 4 1 8 10 2.103 0.551 肿瘤直径(d/cm)    < 5 60 7 4 11 38   ≥5 40 3 1 22 14 14.733 0.002 浸润深度   黏膜层 4 0 0 1 3   肌层 12 0 1 3 8   浆膜 78 9 4 27 38   外膜 6 1 0 2 3 4.262 0.893 淋巴结转移(个)   0 55 2 2 18 33   1~3 29 5 0 10 14   >3 16 3 3 5 5 14.792 0.022 TNM分期   Ⅰ~Ⅱ期 16 0 1 4 11   Ⅲ~Ⅳ期 84 10 4 29 41 3.361 0.339

表2(Table 2)

表 2 S100P蛋白表达与结直肠癌病人临床病理特征的关系(例)

表 2 S100P蛋白表达与结直肠癌病人临床病理特征的关系(例) 临床病理特征 n S100P χ2 P 阴性 弱阳性 阳性 强阳性 性别   男 61 19 18 21 3   女 39 16 8 15 0 3.429 0.330 年龄(岁)    < 60 35 15 11 9 0   ≥60 65 20 15 27 3 4.758 0.190 分化程度   低分化 24 4 4 15 1   中分化 66 26 20 19 1   高分化 10 5 2 2 1 13.298 0.039 肿瘤部位   左半结肠 77 24 20 31 2   右半结肠 23 11 6 5 1 3.272 0.352 肿瘤直径(d/cm)    < 5 60 22 13 24 1   ≥5 40 13 13 12 2 2.758 0.430 浸润深度   黏膜层 4 1 1 2 0   肌层 12 6 3 3 0   浆膜 78 27 19 29 3   外膜 6 1 3 2 0 4.391 0.884 淋巴结转移(个)   0 55 25 12 17 1   1~3 29 8 11 10 0   >3 16 2 3 9 2 14.945 0.021 TNM分期   Ⅰ~Ⅱ期 16 7 4 5 6   Ⅲ~Ⅳ期 84 28 22 31 3 1.115 0.774

结直肠癌组织SATB2与S100P的表达呈负相关(r=－0.254，P < 0.05)，与β-catenin的异常表达呈负相关(r=－0.258，P < 0.05)，与E-cadherin表达不相关(r=－0.045，P>0.05);S100P与β-catenin的异常表达呈正相关(r=0.284，P < 0.05)，与E-cadherin表达不相关(r=0.128，P>0.05)。见表 3~5。

表3(Table 3)

表 3 结直肠癌组织中SATB2和S100P表达的相关性(例)

表 3 结直肠癌组织中SATB2和S100P表达的相关性(例) SATB2表达 n S100P表达 阴性 弱阳性 阳性 强阳性 阴性 10 1 3 5 1 弱阳性 5 0 1 4 0 阳性 33 11 10 10 2 强阳性 52 23 12 17 0

表4(Table 4)

表 4 结直肠癌组织中SATB2与β-catenin、E-cadherin表达的相关性(例)

表 4 结直肠癌组织中SATB2与β-catenin、E-cadherin表达的相关性(例) SATB2表达 n β-catenin表达 E-cadherin 正常 异常 弱阳性 阳性 强阳性 阴性 10 2 8 0 2 8 弱阳性 5 3 2 2 1 2 阳性 33 15 18 5 12 16 强阳性 52 34 18 8 16 28

表5(Table 5)

表 5 结直肠癌组织中S100P与β-catenin、E-cadherin表达的相关性(例)

表 5 结直肠癌组织中S100P与β-catenin、E-cadherin表达的相关性(例) S100P表达 n β-catenin表达 E-cadherin 正常 异常 弱阳性 阳性 强阳性 阴性 35 24 11 9 7 19 弱阳性 26 16 10 2 13 11 阳性 36 13 23 4 11 21 强阳性 3 1 2 0 0 3

国内外研究均发现，在结直肠癌组织中存在SATB2的蛋白表达降低，并与结直肠癌的转移和浸润紧密相关^[10-11]。何兴状等^[12]应用实时荧光定量PCR方法检测了120例结直肠癌及其癌旁组织中SATB2 mRNA的表达, 结果显示72.5%的癌组织SATB2 mRNA低表达，而76.6%的癌旁组织中SATB2 mRNA高表达; CCK-8法与细胞划痕实验结果表明，在SW480、LOVO细胞中SATB2蛋白表达下调增强了细胞增殖以及转移的能力，认为SATB2基因可能为结直肠癌新的治疗靶点。最近几年，国内外学者在结直肠癌中S100P蛋白异常表达方面的研究也越来越多。FUENTES等^[13]研究发现，结肠癌中S100P蛋白特异性表达，在SW480结肠癌细胞株(本身不表达S100P蛋白)中导入外源性的S100P基因，SW480结肠癌细胞株的增殖和转移能力都有明显的提高。李晓燕等^[14]的研究也表明，结直肠癌组织中S100P蛋白的表达高于正常组织，且S100P表达与肿瘤组织的TNM分期和淋巴结转移有相关性，认为S100P在人结直肠癌的发生、发展中可能有一定的作用。

本实验结果显示，结直肠癌组织中SATB2蛋白表达明显低于癌旁正常黏膜组织，并且与肿瘤直径、分化程度、淋巴结转移有关，而与性别、年龄、肿瘤部位、浸润深度、TNM分期等无关; 而S100P蛋白在结直肠癌组织中表达高于癌旁正常黏膜组织，并与肿瘤分化程度、淋巴结转移有关，与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤直径、浸润深度、TNM分期等无关。提示SATB2和S100P基因可能参与结直肠癌的发生和进展过程，检测SATB2和S100P在结直肠癌中的表达水平可反映肿瘤的生物学行为。

多项研究表明，结直肠癌发生与Wnt、EGFR信号通路的激活、抑癌基因失去活性及TGF β信号的缺失等因素有关^[15]。王凤等^[4]对150例结直肠癌组织SATB2及EMT相关蛋白表达检测发现，结直肠癌组织SATB2蛋白的低表达促进β-catenin蛋白的异常表达，从而促进了EMT的发生。有研究表明，β-catenin是Wnt通路的关键性分子之一，可激活Wnt通路^[16]。当肿瘤发生时，S100P蛋白与其靶蛋白钙周期结合蛋白(CacyBP/SIP)结合，阻止β-catenin的正常降解，使其含量剧增，促使Wnt信号通路激活，进而促进肿瘤发生与发展^[17]。SHEN等^[17]研究显示，S100P的过度表达与结肠癌的侵袭和转移表型有关，该表型与EMT有关，且呈晚期糖基化终产物受体(RAGE)依赖性。

本研究相关分析结果显示，结直肠癌组织中SATB2蛋白表达与S100P蛋白表达呈负相关，且与β-catenin蛋白异常表达呈负相关; S100P蛋白表达与β-catenin蛋白异常表达呈正相关。提示结直肠癌组织中可能存在SATB2与S100P基因异常激活或失活，导致SATB2与S100P蛋白异常表达，引起β-catenin积聚和蛋白的异常表达，激活Wnt信号通路，介导结直肠癌EMT的发生，最终促进了结直肠癌肿瘤细胞的增殖与转移。

综上所述，增加SATB2蛋白的表达以及阻断S100P蛋白与其靶蛋白CacyBP/SIP结合，可能会阻止β-catenin蛋白的异常表达、促进β-catenin蛋白的正常降解，从而抑制结直肠癌EMT的持续发生，为结直肠癌的分子靶向治疗提供新的思路。