帕金森病(PD)是第二大常见的神经退行性疾病，其确切病因至今尚未完全明了^[1-3]，其主要病理特征为黑质致密部多巴胺(DA)能神经元缺失和路易小体(LB)形成，临床主要表现有肌强直、静止性震颤、运动迟缓以及姿势不稳等^[4-7]。α-突触核蛋白(α-syn)是SNCA编码的由140个氨基酸组成的小分子蛋白质，是LB的主要成分^[8-10]。大量研究结果表明，PD等突触核蛋白病病人脑脊液中的α-syn水平较正常人显著降低^[11-12]。然而，长期追踪调查发现，PD病人脑脊液中的α-syn水平会随着疾病进展逐渐回升，而且α-syn水平的升高与PD病人后期运动功能的下降存在紧密联系^[13-14]。单胺氧化酶B(MAO-B)是一种线粒体膜蛋白，是单胺类神经递质的主要氧化脱氨酶，可分解DA产生3, 4-二羟基苯基乙醛(DOPAL)等代谢产物^[15-16]。有文献报道，α-syn以及α-syn 1~103片段均可直接结合MAO-B而增强其酶活性，最终导致DA能神经元变性^[17]。本文通过给予小鼠侧脑室注射不同浓度α-syn，以评价其运动功能以及纹状体和黑质区MAO-B蛋白表达的变化。现将结果报告如下。

实验动物：SPF级雄性C57BL/6小鼠，8周龄，体质量(20±2)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于可自由饮水取食、室温(19±2)℃、湿度(50±5)%、昼夜循环光照(12 h/12 h)的清洁环境中。主要试剂：α-syn购自美国rPeptide公司；酪氨酸羟化酶(TH)一抗购自德国Sigma公司；MAO-B一抗购自美国GeneTex公司；Rabbit Anti-β-actin购自中国博奥森公司；Goat Anti-Rabbit IgG二抗购自中国爱必信公司。

将40只实验小鼠随机分为生理盐水组(A组)以及0.04、0.20和2.00 ng α-syn组(B、C、D组)，每组10只。小鼠用异戊烷麻醉后固定在脑立体定位仪上。剪开小鼠颅脑背侧皮肤，用体积分数0.03的过氧化氢溶液擦拭颅骨表面至颅缝和前后囟清晰可见。确定坐标(右侧侧脑室立体定位坐标为前囟后0.3 mm、右旁开1.0 mm、深度2.2 mm)后，将长5.2 mm的套管垂直埋入侧脑室2.2 mm。以1 μL/min的流量注射生理盐水或α-syn 2 μL，每天1次，连续7 d。

小鼠在旋转棒上适应2 min后，将旋转棒转速设置为4~40 r/min，使小鼠随旋转棒自主运动，记录小鼠在旋转棒上运动的时间。测量2次(间隔30 min)取平均值。

小鼠断头，根据小鼠大脑图谱取纹状体和黑质样本并称质量。按照25 μL/mg的比例向样本中加入蛋白裂解液，充分研磨后以12 000 r/min离心20 min，取上清，用BCA试剂盒检测蛋白浓度，加入1/4体积的Loading Buffer后95 ℃金属浴5 min。处理好的蛋白样本进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后转膜(0.45 μm的PVDF膜)。以50 g/L的脱脂奶粉室温封闭2 h后加入一抗TH(1∶3 000)、MAO-B(1∶1 000)、β-actin(1∶10 000)4 ℃孵育过夜，次日用山羊抗兔二抗(1∶10 000)室温孵育1 h，ECL方法显影。用Image J软件分析条带灰度值，TH和MAO-B蛋白表达水平以目的蛋白与内参β-actin条带灰度值的比值来表示。

应用Prism 5软件进行统计学分析。计量资料以x±s形式表示，采用单因素方差分析(one-way ANOVA检验)进行多组均数的比较，继以Tukey方法进行两两均数间的比较。P < 0.05表示差异有统计学意义。

生理盐水组以及0.04、0.20和2.00 ng α-syn组小鼠在旋转棒上运动的时间分别为(221.867±38.855)、(213.905±63.634)、(145.556±54.844)和(138.111±40.932)s，4组比较差异有统计学意义(F=4.877，P < 0.05)。两两比较结果显示，与生理盐水组相比较，0.04 ng α-syn组小鼠运动时间无明显变化(P > 0.05)，而0.20和2.00 ng α-syn组小鼠的运动时间明显缩短，差异具有统计学意义(q=3.907、4.288，P < 0.05)。

本研究4组小鼠纹状体区TH蛋白表达比较差异均无统计学意义(P > 0.05)。4组小鼠纹状体区MAO-B蛋白表达比较差异有统计学意义(F=9.662，P < 0.05)。两两比较结果显示，与生理盐水组相比较，0.04 ng α-syn组小鼠纹状体区MAO-B蛋白表达水平没有明显的变化(P > 0.05)，0.20和2.00 ng的α-syn组小鼠纹状体区MAO-B蛋白表达水平显著升高(q=4.281、6.993，P < 0.05)。见表 1。

表1(Table 1)

表 1 各组小鼠纹状体区TH和MAO-B蛋白表达水平比较(n=6，x±s)

表 1 各组小鼠纹状体区TH和MAO-B蛋白表达水平比较(n=6，x±s) 组别 TH MAO-B A组 1.130±0.135 0.597±0.180 B组 0.979±0.108 0.722±0.160 C组 1.000±0.205 0.976±0.215* D组 1.074±0.191 1.217±0.228* 与A组比较，F=9.662，*q=4.281、6.993，P < 0.05。

本研究4组小鼠黑质区TH和MAO-B蛋白表达比较差异均无统计学意义(P > 0.05)。两两比较结果显示，与生理盐水组相比，各浓度α-syn组小鼠黑质区TH和MAO-B蛋白表达水平均没有明显改变(P > 0.05)。见表 2。

表2(Table 2)

表 2 各组小鼠黑质区TH和MAO-B蛋白表达水平比较(n=6，x±s)

表 2 各组小鼠黑质区TH和MAO-B蛋白表达水平比较(n=6，x±s) 组别 TH MAO-B A组 0.968±0.224 0.901±0.402 B组 0.901±0.122 0.868±0.414 C组 1.016±0.180 0.825±0.324 D组 0.882±0.131 1.000±0.279

编码α-syn的SNCA是首个被人们发现的与PD相关的常染色体显性遗传基因^[18]。无论是在遗传性PD还是在散发性PD中，α-syn均可以在DA能神经元中积聚形成LB^[19]。生理状态下的α-syn通常被认为是舒展的可溶性结构，但当其浓度升高时α-syn易聚合折叠形成寡聚体，对神经元膜有毒性作用，可改变膜渗透性，导致钙大量内流，引起膜除极；也可引起细胞氧化损伤，导致细胞死亡^[20]。细胞内的α-syn还可以被释放到细胞外。人的脑脊液和血浆中存在一定浓度的α-syn^[21]。大量研究发现，PD病人脑脊液中的α-syn水平降低^[11-12]，但随着疾病进展，α-syn水平回升且与病人的认知、运动功能紧密相关^[13-14]。

单胺氧化酶是在中枢神经系统和外周神经系统中催化DA、5-羟色胺和去甲肾上腺素等单胺类神经递质的主要氧化脱氨酶。MAO-B通过分解DA产生DOPAL并产生活性氧(ROS)物质和内源性神经毒素^[16]。年龄相关的MAO-B表达增加与自由基损伤和ROS增加存在密切关联，可导致神经元线粒体功能降低，导致黑质致密部神经元活力降低以至神经变性^[22]。MAO-B抑制剂常被作为有效的PD治疗药物^[23-24]。本研究结果表明，侧脑室注射α-syn 7 d可引起C57BL/6小鼠纹状体区MAO-B蛋白表达升高和运动功能障碍，但黑质区MAO-B蛋白表达不变。MAO-B主要位于星形胶质细胞，在星形胶质细胞激活时MAO-B蛋白表达明显上调，因此MAO-B可能作为星形胶质细胞激活的生化标记物^[25]。α-syn可以通过Toll样受体4(TLR4)激活星形胶质细胞^[26]。因此我们推测，纹状体MAO-B表达升高可能与侧脑室注射的α-syn到达纹状体后激活星形胶质细胞有关，这尚需在后续实验中进一步证实。此外，MAO-B是DA酶解途径之一，当MAO-B表达增加时，一方面MAO-B可促进DA分解；另一方面，DA分解产生的DOPAL还可以激活δ分泌酶，在N103位置裂解α-syn。α-syn以及α-syn 1~103片段均可直接结合MAO-B而增强其酶活性^{[17, 27]}。我们推测，MAO-B表达和活性的增加，可能在未造成DA能神经元损伤之前(本实验观察到黑质和纹状体区TH表达均不变)显著促进了纹状体区DA的分解，造成了小鼠运动功能障碍。与其他脑区相比较，黑质中星形胶质细胞分布相对较少^[28]，这可能是侧脑室注射α-syn未引起黑质区MAO-B蛋白表达变化的原因。

综上所述，侧脑室注射α-syn可引起C57BL/6小鼠纹状体区MAO-B蛋白表达增加和运动功能障碍。本文研究结果为进一步探讨脑脊液中α-syn的变化影响PD疾病进程提供了新的实验思路和理论依据。