2020, Vol. 56
2. 青岛大学附属医院重症医学科, 山东 青岛 2660031
缺血性脑卒中是威胁人类生命的主要疾病之一[1]，其主要危险因素是颈动脉粥样硬化[2]。有研究表明，颈动脉粥样硬化是一种缓慢发展的免疫炎症反应过程[3]，从粥样硬化斑块形成、发展至斑块破裂，多种炎症细胞和炎症因子参与其中[4]。因此，探讨抑制炎症反应的干预措施以控制动脉粥样硬化发生发展，对治疗缺血性脑卒中具有重要意义。褐藻糖胶是海洋类褐藻植物中一种特有的多糖，有研究表明褐藻糖胶能够调节脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞炎症因子释放，抑制核转录因子κB(NF-κB)活化而反应性抑制促炎基因表达[5]，但其对颈动脉易损斑块的作用及具体机制尚未有研究。Nod样受体蛋白3(NLRP3)在动脉粥样硬化发生发展过程中具有重要作用[6-8]，NLRP3基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块及炎症因子白细胞介素-1β(IL-1β)分泌明显降低[9]。本实验通过构建高脂喂养的ApoE-/-小鼠颈动脉粥样硬化易损斑块模型，观察褐藻糖胶对颈动脉斑块NLRP3炎性小体相关蛋白表达影响，探讨褐藻糖胶对颈动脉粥样硬化的作用及其机制。
1 材料和方法 1.1 实验材料褐藻糖胶(Sigma-Aldrich公司), 用0.22 mm孔径过滤器进行过滤，并在-20 ℃条件下保存为褐藻糖胶提取物(10 g/L)，直至使用。6周龄大小C57BL/6背景ApoE-/-基因敲除雄性小鼠(北京Vital River公司)36只，体质量为18~22 g，标准条件下饲养于青岛大学医学部实验动物中心，自由进食、饮水，每笼3只，适应性喂养2周后用于实验。NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸酶-1(Caspase-1)、IL-1β(CST公司)，ELISA检测试剂盒(eBioscience公司), ECL显影液(Millipore公司)。
1.2 动物分组及处理将36只小鼠随机分成对照组、模型组、褐藻糖胶组(实验组)，每组12只。模型组、褐藻糖胶组小鼠于右侧颈总动脉插入颈动脉套管，并给予高脂饲料(每100.00 g饲料含胆固醇0.25 g、脂肪15.00 g)喂养制备小鼠颈动脉粥样硬化斑块模型[10]。对照组不手术，给予普通饲料喂养。模型制备后第4周褐藻糖胶组小鼠给予褐藻糖胶30 mg/(kg·d)腹腔注射，对照组及模型组腹腔注射等量生理盐水, 共注射4周。所有动物研究经青岛大学附属医院实验动物管理委员会批准，并遵循美国国立卫生研究院修订的《实验动物管理和使用指南》[11]。
1.3 检测指标及方法 1.3.1 标本采集小鼠禁食12 h(正常饮水)，腹腔注射100 g/L水合氯醛(3 mL/kg)麻醉，内眦动脉取血；处死小鼠后固定于鼠板，沿颈部正中线剪开皮肤，暴露右侧颈总动脉，然后剪下套管两端长度约0.5 cm血管。
1.3.2 血脂测定取小鼠内眦动脉血约3 mL，3 000 r/min离心取上清，测定总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)水平。
1.3.3 病理观察将离体的右侧颈总动脉用40 g/L多聚甲醛固定，乙醇脱水、浸蜡包埋、切片，苏木精-伊红(HE)染色，光镜下观察血管动脉粥样硬化形成情况。
1.3.4 血清IL-1β、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平检测采用ELISA方法分别检测血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平，按试剂盒说明书操作。
1.3.5 颈动脉粥样硬化斑块组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β水平测定应用Western Blot方法。用RIPA裂解液裂解颈动脉组织，BCA法测定蛋白质含量，SDS-PAGE电泳分离蛋白，然后转到PVDF膜上。室温封闭后2 h后与一抗(1:1 000)4 ℃孵育过夜。用TBST洗涤后，加二抗在室温下孵育1 h，ECL显影。应用图像分析软件对图像进行分析，以目的条带与GAPDH的灰度值比值表示蛋白相对表达量。
1.4 统计学处理采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计量资料结果以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组内两两比较采用LSD法。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组小鼠血清脂质水平比较模型组血清TC、TG、LDL水平与对照组比较明显升高，而褐藻糖胶组血清TC、TG、LDL水平较模型组明显降低，差异有统计学意义(F=8.31~126.25，P<0.05)。见表 1。
| 表 1 各组血脂水平比较(n=12, c/mmol·L-1，x±s) |
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光镜下可见，对照组小鼠血管未见明显粥样斑块，管壁3层结构明显，内膜完整；模型组小鼠颈动脉内见明显粥样硬化斑块形成，斑块内见泡沫细胞浸润，部分破裂，血栓形成；而褐藻糖胶组小鼠颈动脉内粥样斑块明显减轻，泡沫细胞减少。见图 1。
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| A：对照组；B：模型组；C：褐藻糖胶组。HE染色，200倍。 图 1 各组小鼠颈动脉粥样硬化易损斑块的组织学观察 |
模型组小鼠血清炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达较对照组升高，褐藻糖胶组各血清炎症因子水平较模型组下降，差异有统计学意义(F=60.21~190.73，P<0.05)。见表 2。
| 表 2 各组小鼠血清炎症因子含量比较(n=12, ρ/ng·L-1，x±s) |
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与对照组比较，模型组小鼠颈动脉粥样硬化易损斑块中NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表达明显增高; 与模型组比较，褐藻糖胶组NLRP3、Caspase-1、IL-1β表达降低，差异有显著性(F=50.22~120.59，P<0.05)。见图 2、表 3。
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| A：对照组；B：模型组；C：褐藻糖胶组。 图 2 Western Blot检测各组颈动脉粥样硬化斑块中NLRP3炎性小体通路相关蛋白表达 |
| 表 3 各组小鼠各蛋白表达比较(n=10, x±s) |
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炎症在动脉粥样硬化发生和发展以及血栓形成中起着重要的作用[3]。褐藻糖胶是以L-褐藻糖为基础的多糖，具有多种生物学功能，包括抗炎、抗血管生成、抗凝血、抗肿瘤等，是天然海洋药物研究的热点[12-14]。然而，褐藻糖胶在动脉粥样硬化中的作用及其机制尚不清楚。本文利用颈动脉套管合并高脂饲料饲养构建ApoE-/-小鼠颈动脉粥样硬化易损斑块模型，探讨褐藻糖胶对ApoE-/-小鼠颈动脉粥样硬化的作用及其机制。
有研究结果显示，褐藻糖胶可以调节高脂喂养ApoEshl小鼠血脂水平及动脉粥样硬化进展[15]。本文结果与其一致。本文结果显示，褐藻糖胶干预后小鼠血清TC、TG和LDL水平较模型组明显降低；病理观察显示，与对照组相比，模型组颈动脉血管内壁有大量脂质及泡沫细胞堆积，血管腔严重堵塞，而褐藻糖胶组颈动脉血管内壁斑块面积及脂滴明显减少，提示褐藻糖胶能够缓解小鼠颈动脉粥样硬化易损斑块的发生和进展。TNF-α介导全身炎症和免疫反应，在慢性炎症性疾病的发生发展过程中均发挥作用[16-17]。IL-6及IL-1β都是促炎性细胞因子，可刺激炎症的产生，促进免疫性疾病的发生，在动脉粥样硬化过程中起到重要作用[18-20]。有研究显示，褐藻糖胶能够调节LPS诱导的巨噬细胞释放TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子[21]。本文ELISA检测显示，褐藻糖胶能够明显降低ApoE-/-小鼠炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α分泌。表明褐藻糖胶能够通过抑制炎症反应而发挥抗动脉粥样硬化作用。
研究表明，褐藻糖胶能够影响炎症因子IL-1β表达, 而在众多调节炎性因子IL-1β成熟和分泌的通路中，NLRP3炎性小体依赖性的经典通路尤为重要[7, 20]。NLRP3炎症小体是NLRs家族中的一员，是由感受蛋白NLRP3、衔接蛋白凋亡相关斑点样蛋白ASC和效应蛋白激酶Caspase-1等组成的复合物[22-23]。已有研究显示，胆固醇结晶、氧化低密度脂蛋白、血流动力异常都会激活单核巨噬细胞NLRP3炎症小体，进而诱导Caspase-1介导的炎性细胞因子IL-1β的成熟分泌，导致心脑血管疾病和事件的发生[24]。因此，抑制NLRP3炎性小体能够控制动脉粥样硬化的发展，稳定动脉粥样硬化斑块，降低因不稳定斑块造成的缺血性脑卒中的风险。本文采用Western Blot方法检测小鼠颈动脉粥样硬化斑块组织NLRP3炎性小体及IL-1β水平，结果显示，与模型组相比较，褐藻糖胶组NLRP3蛋白的表达降低，Caspase-1蛋白及下游炎性细胞因子IL-1β表达减少，一定程度上表明褐藻糖胶能够通过下调NLRP3炎性小体相关蛋白表达而发挥抗炎作用。
综上所述，褐藻糖胶能够通过下调NLRP3炎性小体通路抑制炎症而发挥抗颈动脉粥样硬化作用。本文结果可为抗动脉粥样硬化辅助治疗提供候选药物。
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