脑卒中作为一种常见的脑血管疾病，对病人的危害较大，可引起脑组织及远隔脏器损伤，其中肺损伤较为常见^[1-2]。脑卒中相关性肺炎(SAP)是急性缺血性脑卒中的常见并发症，也是死亡原因之一^[3]。脑卒中可导致炎症反应失衡，致使肺组织过度分泌炎症介质，造成肺组织受损^[4]。因此，控制肺组织的炎症反应是改善脑卒中诱发肺部感染的关键。高迁移率族蛋白B1(HMGB1)是一种非常重要的炎症因子，与多种疾病有关^[5]，但HMGB1在SAP中的研究较少。甘草酸能抑制多种疾病的炎症反应，具有抗氧化、抗凋亡和抗炎等作用^[6-7]，但其在SAP中的作用尚不清楚。本研究旨在探讨甘草酸对SAP小鼠肺组织炎性损伤的影响，并初步探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验动物

SPF级C57BL/6J雄性小鼠31只，6~8周龄，体质量为18~20 g，购于济南朋悦实验动物繁育有限公司。小鼠在室温(23±2) ℃、相对湿度(45±15)%、12 h/12 h昼夜循环光照的环境下适应性喂养1周，期间可自由获取食物和饮水。动物实验获得青岛大学附属医院实验动物伦理委员会批准(AHQU-MAL20230512LSH)。

1.1.2 主要试剂

甘草酸购自MedChemExpress公司；免疫组化染色试剂盒及苏木精-伊红(HE)染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；氯化钠注射液、二氨基联苯胺(DAB)显色剂和中性树胶封片剂购自武汉塞维尔生物科技有限公司。

1.2 实验方法 1.2.1 实验分组

随机取8只小鼠作为假手术组，剩余23只小鼠用于模型组和甘草酸组造模。其中模型组12只，造模成功8只，死亡4只；甘草酸组11只，造模成功8只，死亡3只。最终假手术组、模型组、甘草酸组小鼠各8只。

1.2.2 SAP模型构建

小鼠吸入体积分数为0.035的异氟醚麻醉后，以俯卧位固定于立体定位仪上^[8]。以小鼠前卤门为基准点，进行皮肤消毒。于矢状缝附近建1个2 mm卒中窗口。光照前5 min腹腔注射孟加拉玫瑰红。将直径为4 mm光纤放入卒中窗口内并固定，小鼠的行程窗口暴露在绿色激发光下15 min。术后小鼠缝合皮肤，放回笼内，自由摄食和饮水。若造模后48 h内小鼠出现进食减少、饮水增多、耳缘静脉突起、毛发粗糙等症状，则判定为造模成功。假手术组只腹腔注射同等剂量孟加拉玫瑰红，不给予光照，其他操作同模型组；甘草酸组术前30 min给予小鼠腹腔注射50 mg/kg甘草酸，其余操作同模型组。

1.2.3 甘草酸预处理及标本采集

在建立SAP模型前30 min，给予小鼠腹腔注射甘草酸50 mg/kg^[9]。术后第3天，给予各组小鼠腹腔注射过量戊巴比妥钠深度麻醉，迅速取出肺组织。先对右肺进行快速洗涤，随后将其置于40 g/L多聚甲醛中固定，然后进行肺组织的病理学检查；左肺用于计算肺湿干质量比。

1.2.4 肺组织病理学观察

取右肺上叶于40 g/L多聚甲醛中固定24 h，用石蜡包埋，切成4 μm厚的切片，按照HE染色试剂盒说明进行染色，用光学显微镜在400倍镜视野下收集图像，观察肺组织病理学的变化。

1.2.5 肺湿干质量比计算

取左肺按照文献方法记录湿质量及干质量，计算肺湿干质量比^[10]。

1.2.6 HMGB1蛋白的免疫组织化学检测

按照文献方法进行操作^[11]。在光学显微镜下拍照。收集400倍视野下的图像，用Image J软件对各组小鼠肺组织内HMGB1阳性面积占比进行量化。

1.3 统计学分析

应用GraphPad Prism 10.1.2软件进行统计学分析。计量资料数据以x±s表示，多组数据比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Bonferroni检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组肺组织病理改变比较

HE染色显示，假手术组小鼠肺泡结构完整，肺泡腔内没有炎性渗出物。与假手术组相比，模型组小鼠肺胞腔变窄、塌陷，肺泡壁增厚，部分肺泡受损及炎症细胞浸润，并伴有充血、出血等。与模型组相比，甘草酸组小鼠肺组织病理变化有一定程度的改善，如肺泡结构比较完整、组织结构清晰、炎性细胞浸润减少、红细胞渗出减少，表明甘草酸可以减轻SAP肺组织损伤。见图 1。

2.2 各组肺湿干质量比的比较

假手术组、模型组、甘草酸组的肺湿干质量比分别为2.61±0.27、6.23±0.60和4.21±1.01，3组间比较差异有统计学意义(F=20.53，P < 0.01)。两两比较结果显示，模型组小鼠肺湿干质量比较假手术组显著增高(P < 0.01)，而甘草酸组小鼠肺湿干质量比较模型组显著降低(P < 0.05)。

2.3 各组肺组织HMGB1阳性面积占比比较

免疫组化染色结果显示，假手术组HMGB1主要在肺组织细胞核内表达，模型组HMGB1主要在细胞质中表达。假手术组、模型组、甘草酸组小鼠肺组织内HMGB1的阳性面积占比分别为(1.05±0.40)%、(3.46±0.41)%和(2.35±0.42)% (n=3)，3组间比较差异具有统计学意义(F=26.30，P < 0.01)。两两比较结果显示，模型组小鼠肺组织内HMGB1阳性面积占比较假手术组增高(P < 0.01)，而甘草酸组小鼠肺组织内HMGB1阳性面积占比较模型组降低(P < 0.05)。见图 2。

3 讨论

SAP会增加急性缺血性脑卒中病人的死亡风险、住院率和治疗费用等^[12-13]。有研究表明，SAP可使脑卒中病人30 d病死率增加达3倍^[14]，并增加卒中后1年和3年的死亡风险^[15-16]。目前，SAP的治疗主要包括一般治疗(化痰及痰液引流、氧疗及呼吸支持等)、早期营养支持、抗生素抗感染、中医中药治疗等^[17]，但治疗效果一般，难以达到令人满意的程度。目前缺乏良好的靶向治疗药物，这使得SAP的治疗面临着巨大的挑战。因此，迫切需要探寻有效的治疗药物来改善SAP病人的预后。甘草酸在许多疾病中都有研究，但在SAP中的研究相对较少。因此，本研究主要探讨甘草酸对SAP小鼠肺组织病理学变化的影响及其可能的作用靶点。

甘草酸是甘草根的主要活性成分，被广泛用于中医临床，具有很多重要作用，例如抗病毒、降低炎症反应、抗癌、抗氧化等作用^[18-20]。本文研究结果表明，甘草酸可以改善SAP小鼠肺水肿程度和肺组织病理损伤，提示甘草酸可以减轻SAP小鼠肺组织的炎症反应，但其机制尚不清楚。

HMGB1是许多肺部疾病发病的生物标志物和炎症介质^[21]。HMGB1是一种普遍存在的核蛋白，可调节许多肺部疾病发病相关基因的表达，还可调节染色质结构。HMGB1主要定位于正常细胞的细胞核中。当细胞受损或坏死时，细胞内的HMGB1会被激活并从细胞核释放到细胞质中。细胞外的HMGB1作为一种重要的炎症介质，可激活巨噬细胞和中性粒细胞等免疫细胞，引发炎症反应的级联放大。HMGB1可以与细胞表面受体(如晚期糖基化终末产物受体)结合，启动一系列信号转导通路，导致炎症细胞因子的释放，进一步加重肺部的炎性损伤^[22]。无论是主动分泌还是被动释放，细胞外HMGB1都是可以触发炎症反应的危险信号^{[21, 23]}。甘草酸作为HMGB1的抑制剂，可干扰HMGB1与细胞表面受体的相互作用，减少趋化因子和细胞因子介导的炎症级联反应，降低炎症因子的水平^[24-25]。在以HMGB1为靶点的抑制剂中，甘草酸的应用最为广泛和有效^[26]，因此，本研究选择甘草酸作为干预药物，探讨其对SAP模型小鼠肺组织炎性损伤的影响及机制。本文研究结果显示，模型组小鼠肺组织中HMGB1阳性面积占比高于假手术组，且模型组小鼠的组织病理学损伤严重，肺水肿程度也高于假手术组；甘草酸组小鼠肺组织中HMGB1阳性面积占比较模型组降低，组织病理学损伤和肺水肿程度也较模型组有一定程度的改善。提示甘草酸可能通过抑制HMGB1的表达来减轻SAP模型小鼠肺部的炎症反应。

综上，甘草酸可以改善SAP小鼠肺组织的炎性损伤，这为SAP的治疗提供了新的线索。但本研究仍有许多问题需要进一步深入探讨。在后续的实验中，可以进一步检测肺组织中炎症因子及相关蛋白的表达，以更全面地了解甘草酸对SAP的治疗作用机制。同时，可以深入研究甘草酸抑制HMGB1表达的具体分子机制，包括信号通路的调节、基因表达的调控等多个层面。此外，还可以探讨甘草酸与其他治疗方法的联合应用，以提高治疗效果。对甘草酸在SAP中作用机制的深入研究，有望为SAP的治疗提供更充分的理论依据。