肺癌是世界上导致病人死亡的主要疾病之一，其进展机制一直是研究的重点，而研究表明趋化因子在肺癌的发生发展中扮演重要角色^[1-4]。趋化因子是一类小细胞因子，趋化因子配体12(CXCL12)是趋化因子家族中研究最广泛的成员^[5-6]。研究表明，CXCL12在肿瘤中广泛高表达，影响肿瘤的进展^[7-8]。CXCL12与其特异性受体趋化因子受体4(CXCR4)相互作用后，诱导下游信号通路，促进细胞的迁移和侵袭^{[2, 6, 9]}。CXCL12可以促进蛋白激酶B(AKT)的磷酸化，而AKT信号通路的激活可以诱导肿瘤细胞的自噬^[10-12]。有研究结果表明，自噬可以促进肿瘤的自我更新和发展，但是在不同的肿瘤和环境中，自噬又可以抑制肿瘤的进展^[13-16]。而CXCL12是否可以通过CXCR4/AKT诱导自噬影响肺癌细胞的侵袭和迁移尚不明确。本研究旨在探讨外源性CXCL12对肺癌细胞迁移的影响及其可能的作用机制。

1 材料与方法 1.1 实验材料

实验细胞A549细胞购自武汉普诺赛生物科技有限公司。CXCR4抗体和兔二抗购自爱必信公司，磷酸化AKT(p-AKT)抗体和β-actin抗体购自CST公司，外源性CXCL12购自Peprotech公司，CXCR4抑制剂AMD3100购自Selleck公司，完全培养基购自普诺赛公司，胎牛血清购自依科赛公司，胰蛋白酶和青霉素-链霉素双抗购自索莱宝公司。

1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养

A549细胞使用含体积分数0.1胎牛血清和体积分数0.01青霉素-链霉素双抗的混合培养液培养。

1.2.2 药物作用

使用AMD3100预处理A549细胞1 h，然后再加入0.1 mg/L的外源性CXCL12共同培养24 h。

1.2.3 划痕实验

将A549细胞接种于6孔板中，待细胞长满后用200 μL的枪头在板中央划线，然后用PBS洗3遍，将漂浮的细胞洗去，此时作为0 h拍照。用含体积分数0.01胎牛血清的培养液继续培养，分别在培养24、48 h时拍照，然后计算愈合率。

1.2.4 自噬相关蛋白及CXCR4/AKT信号通路蛋白Western blot检测

用RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的混合液裂解细胞0.5 h，在4 ℃下以20 000 r/min离心15 min，取蛋白上清。用BCA试剂盒测蛋白浓度后，将所有蛋白样本稀释至同一浓度，然后加上样缓冲液，沸水煮5 min。制备SDS聚丙烯酰胺凝胶，加入蛋白样本20 μg，电泳分离蛋白，然后使用PVDF膜300 mA湿转1 h。转膜后用含50 g/L脱脂牛奶的TBST溶液封闭2 h，以PBST洗3遍后加一抗4 ℃孵育过夜。吸去一抗，以PBST洗3遍，加入二抗常温孵育2 h，以PBST洗3遍，用ECL发光液显影。使用Image J软件分析蛋白条带的灰度值，蛋白表达水平以目的蛋白与内参蛋白灰度值的比值表示。

1.3 统计学处理

使用GraphPad Prism 9.0软件进行统计学分析。计量资料结果以x±s表示，两组比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 CXCL12对A549细胞迁移的影响

划痕实验结果显示，与对照组相比，加入外源性CXCL12组细胞的迁移能力增强，差异有统计学意义(t=3.949，P < 0.05)。见图 1。

2.2 CXCL12对A549细胞自噬的影响

Western blot实验结果显示，与对照组相比，加入外源性CXCL12组细胞自噬蛋白LC3B Ⅱ的表达增高，差异具有统计学意义(t=3.051，P < 0.05)。见图 2。

2.3 CXCL12对CXCR4/AKT信号通路的影响

Western blot实验结果显示，与对照组相比，加入外源性CXCL12组细胞CXCR4及p-AKT的表达增加，差异有统计学意义(t=2.974、4.307，P < 0.05)。见图 3。

3 讨论

本实验使用外源性CXCL12作用于肺癌A549细胞，然后对细胞的迁移能力进行检测，结果显示，加入外源性CXCL12可以明显促进肺癌细胞的迁移。现有的研究发现，CXCL12可以调节骨髓的肿瘤微环境，利于肿瘤转移^[17]。CXCL12可以明显促进乳腺癌向骨髓和其他部位的转移，并且CXCL12的表达还与乳腺癌向肝脏和肺部的转移密切相关^[18-20]。此外，CXCL12可以通过激活ERK1/2信号通路维持食管癌干细胞高水平的转移特征，证明CXCL12是影响食管癌的潜在靶点之一^[21-22]。这些研究结果与本研究结果相一致，表明CXCL12可以促进肿瘤的转移，是影响多种肿瘤转移的潜在分子。但是有研究结果显示，CXCL12可显著减缓胰腺癌在体外的生长，并且使体内肿瘤也明显变小，此外，CXCL12还导致肿瘤细胞在体外的黏附性和迁移性变差，在体内的转移性变弱^[23]。这说明CXCL12对肿瘤转移的影响在不同肿瘤中扮演着不同的角色，尚需继续探究CXCL12在不同肿瘤转移中的具体作用和机制。目前已经确定CXCL12是影响肿瘤进展的一个重要分子，对CXCL12的继续研究可以为肿瘤的治疗提供新的策略。

目前的研究发现，外源性CXCL12在促进肺癌细胞迁移的同时，可以促进细胞的自噬。而自噬抑制剂氯喹可以抑制CXCL12介导的癌细胞迁移^[24]。本实验结果显示，CXCL12可以促进自噬标志性蛋白LC3B Ⅱ的表达，提示CXCL12可能是通过诱导肺癌细胞的自噬促进细胞迁移。有研究结果表明，CXCL12可以与CXCR4结合，然后诱导细胞内信号传导，参与肿瘤的转移^[25-29]。为了探究CXCL12是否是通过CXCR4激活AKT发挥作用，本实验在肺癌细胞中加入外源性CXCL12，对CXCR4的表达和AKT的磷酸化水平进行检测，结果显示，外源性CXCL12可以促进肺癌细胞CXCR4的表达和AKT的磷酸化。有研究结果表明，CXCL12/CXCR4可以通过激活AKT信号通路促进胶质母细胞瘤细胞的迁移^[30]，并且CXCR4的抑制剂AMD3100可以抑制CXCR4介导的骨肉瘤转移^[31-32]。但是，目前尚无研究证明在肺癌中CXCL12可通过CXCR4/AKT信号通路诱导自噬促进肺癌的转移。所以，本研究首次对此进行了探讨，结果表明CXCL12可能通过CXCR4/AKT诱导自噬进而发挥促肺癌细胞迁移的作用。

综上，CXCL12可促进肺癌细胞的迁移和自噬，并且可促进CXCR4的表达和AKT的磷酸化，提示CXCL12可能通过CXCR4/AKT诱导自噬，进而促进肺癌细胞的迁移。本文结果为肺癌的治疗提供了新的研究方向。但本研究仅探讨了CXCL12诱导肺癌细胞自噬和迁移的相关性，两者的具体作用还有待进一步研究和探讨。