2024, Vol. 60
糖尿病性白内障(DC)是糖尿病的主要并发症，会导致视力障碍或失明[1-3]。高糖(HG)在DC的发展中发挥重要作用，并可通过诱导晶状体上皮细胞(LEC)的凋亡和氧化应激引发晶状体混浊[4-6]。在特定的条件下，自噬可以抑制细胞凋亡和氧化应激，清除LEC蛋白和降解的细胞器，维持晶状体的透明度[7-8]。因此，探索DC的发病机制对寻找有效的治疗方法至关重要。黄柏碱具有降血糖、抗氧化、抗炎、降压以及免疫调节等作用[9]，它可以通过调节多种信号通路对抗糖尿病[10]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)可调节细胞和器官的生长，雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是AMPK的关键下游靶标，可以调节细胞翻译、转录和自噬，AMPK信号通路参与调控DC的自噬[11-13]。此外，黄柏碱通过调节AMPK/mTOR通路促进自噬[14-16]。目前尚不清楚黄柏碱是否能通过调节AMPK/mTOR通路影响HG诱导的LEC自噬和凋亡。本研究探讨了黄柏碱对HG诱导的LEC自噬和凋亡的影响及其机制。
1 材料与方法 1.1 实验材料及仪器人LEC(HLEB3细胞系，美国ACCT细胞库)；黄柏碱(纯度≥98%，成都植标化纯生物有限公司)；DCFH-DA试剂盒以及Compound C(美国MedChemExpress公司)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(上海酶联生物公司)；胎牛血清(FBS)、DEME培养液(美国Gibco公司)；细胞计数(CCK-8)检测试剂盒、AnnexinV-FITC/PI检测试剂盒(上海碧云天公司)；一抗蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、自噬蛋白Beclin-1、微管相关蛋白轻链3(LC3)-Ⅰ/Ⅱ、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR和内参β-actin抗体(美国赛默飞公司)；二抗山羊抗兔IgG(南京建成生物工程研究所)。流式细胞仪(北京安诺伦公司)；透射电子显微镜(日本Olympus公司)；荧光显微镜(德国徕卡公司)；全自动酶标仪(美国Biotek公司)。
1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养将HLEB3细胞置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2和体积分数0.10 FBS的DMEM培养液中培养。当细胞复苏至80%时，用胰酶消化传代，每隔2~3 d传代1次。将复苏后的HLEB3细胞分为对照组(5.5 mmoL/L葡萄糖培养液培养)和HG组(30.0 mmoL/L葡萄糖培养液培养)，分别培养至对数生长期。
1.2.2 黄柏碱最佳浓度筛选取对数生长期的对照组HLEB3细胞，以每孔1×104个细胞的密度接种至96孔板中，使用不同浓度的黄柏碱(0、1、3、5、7、9 mg/L)培养24 h；处于对数生长期的HG组HLEB3细胞处理同对照组，后在30.0 mmol/L葡萄糖培养液中培养24 h。每组重复3次，细胞处理完成后，每孔加入100 g/L CCK-8溶液(10 μL)在37 ℃孵育2 h，用酶标仪测量450 nm波长处的吸光度值，计算细胞活力。筛选出黄柏碱最佳浓度用于后续实验。
1.2.3 实验分组将HLEB3细胞分为对照组(A组)、HG组(B组)、黄柏碱组(C组)、Compound C(AMPK抑制剂)组(D组)。其中黄柏碱组细胞用筛选出的最佳浓度(5 mg/L)的黄柏碱处理24 h，在30.0 mmol/L的葡萄糖培养液中培养24 h；Compound C组细胞用10 mmol/L Compound C[17]和5 mg/L黄柏碱培养24 h，后在30.0 mmol/L葡萄糖培养液中培养。
1.2.4 CCK-8法检测细胞活力取各组细胞以每孔1×103个细胞密度接种于96孔板，培养24 h。然后每孔加入100 g/L CCK-8溶液(10 μL)在37 ℃孵育2 h，用酶标仪测量450 nm波长处的吸光度值，计算细胞活力。每组重复3次。
1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡取各组细胞以每孔1×105个细胞密度接种于6孔板中，培养12 h。按照AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒说明书逐步进行染色，用流式细胞仪检测细胞凋亡。
1.2.6 电镜超微结构观察将各组细胞置25 g/L戊二醛溶液中4 ℃固定过夜，后在室温下固定、脱水，环氧树脂包埋处理，切片染色，并在透射电镜下观察拍照。
1.2.7 氧化应激指标检测对各组细胞ROS、MDA、SOD水平进行检测，采用活性氧荧光探针(DCFH-DA)法检测细胞内ROS含量，并在荧光显微镜下观察拍照；MDA、SOD水平按照ELISA试剂盒说明书进行检测。
1.2.8 Western blot检测蛋白表达将各组细胞破碎后提取总蛋白，用BCA试剂盒进行浓度定量，按步骤将蛋白SDS-PAGE电泳、转膜，50 g/L脱脂奶粉封闭2 h，在4 ℃下加入一抗Bcl-2、Bax、Beclin-1、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR(1∶2 000)和β-actin过夜孵育，清洗，在4 ℃下加入二抗山羊抗兔IgG(1∶1 000)，孵育2 h。用ECL发光显影，观察拍照，各条带的灰度值应用Image J软件处理分析。
1.3 统计学处理采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 8.0软件进行数据的统计学处理。计量资料以x±s形式表示，多组数据比较采用单因素设计方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 黄柏碱最佳浓度筛选在对照组HLEB3细胞中，与0 mg/L黄柏碱相比，1、3、5 mg/L黄柏碱干预对细胞活力无显著影响(P＞0.05)，7、9 mg/L黄柏碱干预显著抑制细胞活力(F=38.422，P＜0.001)。见图 1。在HG诱导HLEB3细胞中，与0 mg/L黄柏碱相比较，1、3、5、7、9 mg/L黄柏碱干预显著提高了细胞活力(F=55.220，P＜0.001)，其中5 mg/L黄柏碱的干预效果最显著，故选择5 mg/L作为黄柏碱后续实验浓度。见图 2。
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| 与0 mg/L黄柏碱比较，*P<0.05。 图 1 不同浓度黄柏碱对对照组HLEB3细胞活力的影响 |
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| 与0 mg/L黄柏碱比较，*P<0.05；与5 mg/L黄柏碱比较，#P＜0.05。 图 2 不同浓度黄柏碱对HG诱导HLEB3细胞活力的影响 |
A~D组细胞活力分别为(100.00±0)%、(38.65±4.01)%、(83.07±8.26)%和(42.07±4.38)%，4组比较差异有显著性(F=213.971，P＜0.001)。与A组相比，B组细胞活力显著降低(P＜0.05)；与B组相比，C组细胞活力显著升高(P＜0.05)；与C组相比，D组细胞活力显著降低(P＜0.05)。
2.3 各组细胞凋亡率及凋亡蛋白表达比较本文4组细胞凋亡率、Bax和Bcl-2蛋白表达比较，差异均有显著性(F=19.111~156.780，P＜0.001)。与A组相比，B组细胞凋亡率、Bax蛋白表达显著升高，Bcl-2蛋白表达显著降低(P＜0.05)；与B组相比，C组细胞凋亡率、Bax蛋白表达显著降低，Bcl-2蛋白表达显著升高(P < 0.05)；与C组相比，D组细胞凋亡率、Bax蛋白表达显著升高，Bcl-2蛋白表达显著降低(P＜0.05)。见图 3、4和表 1。
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| A：对照组；B：HG组；C：黄柏碱组；D：Compound C组。 图 3 各组细胞凋亡流式细胞术检测 |
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| A：对照组；B：HG组；C：黄柏碱组；D：Compound C组。 图 4 各组细胞Bcl-2和Bax蛋白表达Western blot检测 |
| 表 1 各组细胞凋亡率及凋亡蛋白表达比较(n=6，x±s) |
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本文4组细胞自噬蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平比较，差异均有统计学意义(F=48.125、48.467，P＜0.001)。与A组相比，B组自噬体数量减少，Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平显著降低(P＜0.05)；与B组相比，C组自噬体数量增加，Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平显著升高(P＜0.05)；与C组相比，D组自噬体数量减少，Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平显著降低(P＜0.05)。见图 5、6和表 2。
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| A：对照组；B：HG组：C：黄柏碱组；D：Compound C组。透射电镜，放大10 000倍。 图 5 各组细胞超微结构电镜观察 |
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| A：对照组；B：HG组；C：黄柏碱组；D：Compound C组。 图 6 各组细胞自噬蛋白表达的Western blot检测 |
| 表 2 各组细胞自噬蛋白表达比较(n=6，x±s) |
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本文4组细胞ROS、MDA、SOD水平比较，差异均有统计学意义(F=101.650~106.693，P＜0.001)。与A组相比，B组细胞ROS、MDA水平显著升高，SOD水平显著降低(P＜0.05)；与B组相比，C组ROS、MDA水平显著降低，SOD水平显著升高(P＜0.05)；与C组相比，D组ROS、MDA水平显著升高，SOD水平显著降低(P＜0.05)。见图 7、表 3。
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| A：对照组；B：HG组；C：黄柏碱组；D：Compound C组。 图 7 各组细胞ROS水平检测 |
| 表 3 各组细胞氧化应激指标比较(n=6，x±s) |
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本文4组细胞的p-mTOR/mTOR、p-AMPK/AMPK水平比较，差异均具有统计学意义(F=33.882、30.857，P < 0.001)。与A组相比，B组细胞p-mTOR/mTOR显著升高，p-AMPK/AMPK显著降低(P < 0.05)；与B组相比，C组细胞p-mTOR/mTOR显著降低，p-AMPK/AMPK显著升高(P < 0.05)；与C组相比，D组细胞p-mTOR/mTOR显著升高，p-AMPK/AMPK显著降低(P < 0.05)。见图 8、表 4。
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| A：对照组；B：HG组；C：黄柏碱组；D：Compound C组。 图 8 各组细胞AMPK/mTOR信号通路相关蛋白表达的Wes-tern blot检测 |
| 表 4 各组细胞AMPK/mTOR通路相关蛋白表达比较(n=6，x±s) |
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LEC是晶状体代谢中最活跃的成分，可以产生晶状体纤维，维持整个晶状体的新陈代谢和透明度[18-19]。HG环境可通过改变晶状体渗透压引起LEC氧化应激失调和自噬，导致细胞凋亡和白内障[20-22]。因此，探讨HG诱导LEC损伤的机制对DC的预防和治疗具有重要意义。本研究以人LEC的HLEB3细胞系作为研究对象，结果显示，HG诱导的细胞活力和自噬水平显著下降，凋亡率和凋亡蛋白增加，并发生氧化应激。提示HG环境导致LEC氧化损伤、细胞凋亡和自噬抑制，从而导致白内障的形成。自噬对于维持细胞、组织和器官的稳态至关重要，包括在眼睛的角膜、视网膜和晶状体中发挥重要作用[23-24]。其中，LEC和纤维细胞中自噬通量受损可能导致先天性白内障、年龄相关性白内障和DC的形成[25-27]。LC3-Ⅱ蛋白是在自噬体形成过程中通过可溶性LC3-Ⅰ与脂质成分结合产生的，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值是早期自噬活性的指标；Beclin-1是Ⅲ类磷酸肌醇3激酶复合物的组成成分，是自噬的主要调节因子[28-29]。在HG条件下，LEC自噬的表达受到抑制。本研究结果显示，HG组细胞自噬体数量减少，Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平显著降低，提示HG可抑制LEC自噬。
HG可诱导氧化应激并降低LEC的抗氧化能力，导致DC形成[30-32]。其中，HG导致氧化还原失衡，产生过量的ROS，造成生物膜脂质氧化产生MDA；SOD属于抗氧化酶，可减轻细胞损伤[33-34]。此外，细胞的增殖和凋亡受自噬的影响。在应激条件下，自噬可以通过维持细胞稳态来防止细胞凋亡；在HG条件下，自噬的减少和氧化应激的发生均会引起LEC损伤和细胞凋亡[35]。Bax和Bcl-2是调节细胞凋亡的蛋白，其中Bax降低和Bcl-2升高表明细胞对凋亡的抵抗力增强[36]。本研究结果显示，HG组的细胞ROS、MDA水平以及凋亡率、Bax蛋白显著升高，而SOD和Bcl-2表达显著降低，提示HG可促进细胞凋亡和氧化应激的发生，从而引起白内障的发生。黄柏碱已被证实具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗糖尿病等活性。研究显示，黄柏碱可通过抑制氧化应激和凋亡，改善脂多糖诱导的肾小管上皮细胞损伤[37]。此外，黄柏碱调节钙信号通路、cGMP-PKG信号通路和cAMP信号通路是其治疗糖尿病的核心机制[10]。本研究结果显示，5 mg/L黄柏碱可增加HG环境下LEC的活力，增加自噬体数量和Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Bcl-2水平，降低凋亡率以及ROS、MDA、Bax水平，提示黄柏碱可能通过抑制细胞凋亡和氧化应激促进自噬，减少白内障的形成。
AMPK在调节葡萄糖、脂质、氨基酸代谢和内分泌等生理活动中发挥重要作用[38-40]。AMPK活性在糖尿病相关疾病中受到抑制，例如，WANG等[41]研究发现，糖尿病心肌病小鼠的AMPK活性和自噬水平均下降。mTOR是AMPK的关键下游靶标，AMPK磷酸化增加可降低mTOR水平，促进下游自噬信号蛋白的表达[42]。相关研究结果表明，调节AMPK-mTOR途径可通过促进自噬改善糖尿病引起的视网膜损伤和细胞凋亡，也可通过促进糖尿病小鼠足细胞自噬而减少细胞凋亡[43-44]。此外，AMPK/mTOR信号通路失调和自噬活性与白内障形成有关。既往有研究结果显示，通过促进AMPK活化和自噬通量恢复可以减轻氧化应激诱导的人LEC衰老[45]；AMPK诱导的自噬在病人的LEC中下调[46]。本文研究结果显示，HG环境下LEC p-mTOR/mTOR水平显著升高，p-AMPK/AMPK水平降低，提示HG可能通过抑制AMPK活性、促进mTOR活化和抑制自噬参与白内障的形成。此外，黄柏碱可能通过激活AMPK/mTOR信号通路来促进自噬，改善溃疡性结肠炎[10]。本文研究结果显示，黄柏碱干预后，p-mTOR/mTOR水平显著降低，p-AMPK/AMPK水平升高，且AMPK抑制剂Compound C可逆转黄柏碱对HLEB3细胞自噬和凋亡的改善作用。推测黄柏碱可能通过AMPK/mTOR信号通路参与对HG诱导的LEC自噬和凋亡的调节。
综上所述，黄柏碱可减轻HG诱导的LEC氧化应激和细胞凋亡，促进细胞自噬，其作用机制可能与调节AMPK/mTOR信号通路有关。本研究为治疗DC中LEC自噬和凋亡提供了一种新方法，但其作用机制有待进一步研究。
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