2024, Vol. 60
当应激发生时，机体通常会做出许多不同的应激反应使个体从生理和心理上来应对应激事件[1]，如情绪、认知和行为的改变[2-4]。束缚应激作为一种广泛应用的动物应激模型，能够精准地反映人类生活中的“发展限制”状态，因此被视为一种良好的低刺激性应激模型[5-6]。根据束缚时间长短和次数，束缚应激分为急性束缚应激(ARS)和慢性束缚应激(CRS)。目前的研究结果表明，ARS对实验鼠的影响随其时间不同以及实验鼠的品种和性别的不同而不同[7-10]。而不同时间ARS对雄性CD1小鼠的情绪和运动功能的影响尚不清楚。因此，本研究利用糖水偏好实验、旷场实验和高架十字迷宫实验，探讨了不同时间ARS对雄性CD1小鼠相关行为学指标影响，以期为ARS诱导的CD1雄鼠模型提供有效的干预手段，进而为深入研究应激的生物学机制奠定坚实基础。
1 材料和方法 1.1 实验材料 1.1.1 动物来源及其饲养实验动物选择8周龄SPF级雄性CD1 (ICR)小鼠，购于北京维通利华实验动物有限公司。按照文献方法[11]饲养小鼠。
1.1.2 主要试剂和仪器蔗糖购于国药集团化学试剂有限公司。45 cm×45 cm×45 cm大小不透明测试盒、高出水平面50 cm的十字形迷宫装置(内部结构包括两个开放臂(大小30 cm×9 cm)和两个闭合臂(大小30 cm×9 cm×15 cm))购于北京吉安得尔科技有限公司。摄像机购于深圳市林柏视科技有限公司。
1.2 实验方法 1.2.1 动物分组及ARS将小鼠随机分为对照组(A组)和ARS模型0.5 h组(B组)、1.0 h组(C组)、2.0 h组(D组)及4.0 h组(E组)，每组10只小鼠(实验中死亡者剔除)。对照组小鼠不做处理。B~E组：将小鼠分别置于小鼠固定器中0.5、1.0、2.0和4.0 h，完成对小鼠的ARS。
1.2.2 糖水偏好实验每组小鼠先进行蔗糖饮水训练。第1天和第2天两侧水瓶中为饮用水；第3天和第4天将两侧水瓶中的饮用水换成10 g/L的蔗糖溶液；第5天一侧水瓶中为饮用水，另一侧为10 g/L蔗糖溶液；第6天更换饮用水和10 g/L蔗糖溶液水瓶的位置；第7天断水1 d；第8天进行ARS造模。ARS后根据文献方法[12]检测小鼠1 h内的蔗糖偏好百分比，并以其评估小鼠抑郁核心症状快感缺失的程度。
1.2.3 旷场实验糖水偏好测试后30 min，按文献方法[11]对小鼠进行旷场实验，对小鼠总移动距离和运动速度进行分析，全面评估其运动能力。
1.2.4 高架十字迷宫实验按照文献方法[8]对小鼠进行高架十字迷宫实验，通过分析小鼠进出开放臂的频率以及在开放臂停留的时间百分比来评估其焦虑程度。
1.3 统计学分析应用Graph Pad Prism 8.0软件进行统计学处理。实验结果计量资料数据以x±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析(One way ANOVA)检验，并继以Newman-keuls法进行组间两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果糖水偏好实验结果显示，与A组小鼠相比，B、C、D和E组小鼠蔗糖偏好百分比差异无统计学意义(P>0.05)。旷场实验结果显示，与A组小鼠相比较，B、C、D和E组小鼠总移动距离和运动速度差异均无统计学意义(P>0.05)。高架十字迷宫实验结果显示，与A组相比较，B、C和D组小鼠进入开放臂的次数明显降低，差异具有统计学意义(q=4.483~6.150，P＜0.01)，在开放臂停留时间明显缩短，差异具有统计学意义(q=3.607~4.665，P＜0.05)；而E组小鼠与A组相比较，无论是进入开放臂次数还是开放臂停留时间，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表 1。
| 表 1 各组小鼠糖水偏好、旷场及高架十字迷宫实验结果比较(x±s) |
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内稳态是指生物控制自身的体内环境使其保持相对稳定，内稳态会随时被内部或外界刺激所扰乱，这种刺激称为应激源[13-16]。个体面对应激源时能够激活交感神经系统，进而做出适当的行为输出[17]。应激源引发的机体适应性反应被称为应激反应，应激反应的影响因素有很多，比如遗传因素和环境因素[18]。当应激发生时，机体通常会做出许多不同的应激反应使个体从生理和心理上来应对这些应激事件[1]，其中包括自主神经系统[19]和内分泌系统以及免疫系统的激活[20-21]、情绪以及认知和行为的改变等[2-4]。在应激强度和方式超出机体平衡范畴时就会出现创伤后遗症、精神失常、焦虑障碍、抑郁症等精神类疾病[22]。动物急性应激模型有很多种，包括电击、空瓶刺激、强迫游泳、束缚应激、寒冷、次声和社交挫败等[23-28]，其中束缚应激作为一种非损伤性刺激，能够很好地模拟人类身心疾病的过程，是一种很常用的应激模型[5-6]。
目前的研究已表明，ARS对实验鼠的行为影响随其时间、实验鼠品种和性别的不同而不同，如同为2 h的ARS在C57BL/6J雄鼠中能使其产生明显的焦虑样行为，但不能影响其运动能力[8]；能使雌性棕色田鼠焦虑，不能使其抑郁；能使雄性棕色田鼠抑郁，而不能使其焦虑[9]。在雌性ICR小鼠中，12 h的ARS能提高其运动水平，使其产生烦躁情绪[10]。在雄性ICR小鼠中，ARS 1 h能显著损害小鼠在新颖物体识别测试中的记忆提取而不能影响其运动能力[29]。在雄性Swiss小鼠中，4 h的ARS能使其产生抑郁样行为[7]。ARS对不同种类小鼠的不同影响反映了不同种类小鼠在适应环境、抵御应激以及应对挑战方面的差异性，通过比较不同品种小鼠在ARS下行为学功能变化，可以发现哪些因素在应激反应中起关键作用，从而为揭示应激的生物学机制提供线索。CD1雄性小鼠与其他小鼠相比，最突出的特征在于其具有高度奋发性以及对环境适应强的特点。然而，ARS不同时间对雄性CD1小鼠的运动和情绪的影响，以及影响是否随时间的变化而变化，目前研究较少。因此，探究不同时间ARS对雄性CD1小鼠的影响可以为急性应激诱导小鼠模型提供新的策略。
蔗糖偏好实验用于评估小鼠的动机、快感不足以及相关的情绪状态，而快感缺失可作为抑郁样行为的一个评估指标[30]；旷场实验是评估动物运动行为的有效方法[31]；高架十字迷宫实验能够评估小鼠的焦虑样行为[32]。本研究设计雄性CD1小鼠建立时间梯度(0.5、1.0、2.0和4.0 h)的ARS模型，探究不同时间ARS对小鼠相关行为学指标的影响。结果显示，与对照组小鼠相比，ARS各组小鼠的蔗糖偏好百分比无明显差异，提示不同时间ARS不会使小鼠产生抑郁样行为。在旷场实验中，与对照组小鼠相比，ARS各组小鼠的总移动距离和运动速度均无明显差异，提示不同时间ARS不能影响小鼠的运动能力。在高架十字迷宫实验中，与对照组小鼠相比，B、C和D组小鼠进入开放臂次数及停留时间明显减少，而E组小鼠进入开放臂次数及停留时间无明显差异，提示0.5、1.0、和2.0 h的ARS能使小鼠产生明显的焦虑样行为。产生这种结果的原因可能是CD1雄鼠对应激反应有一定的适应性，在短期ARS(0.5、1.0和2.0 h)时，CD1雄鼠没有足够的时间去适应这种突如其来的应激情景从而表现出明显的焦虑样行为；当ARS延长至4.0 h，CD1雄鼠可能通过一系列的生理和心理调整，逐渐适应了这种应激状态，因此不会产生焦虑样行为。至于不同时间ARS不影响CD1雄鼠抑郁行为及运动能力，一方面可能是基于CD1雄鼠本身与其他种类小鼠的差异性；另一方面可能是ARS作为一种急性应激，其持续时间尚不足以引发抑郁样行为或显著影响运动能力。虽然抑郁和焦虑都属于情绪障碍，但它们的生理机制和病理生理过程有所不同，需要不同类型或更长时间的应激才能诱发抑郁样行为[33]。
综上所述，不同时间的ARS不能影响CD1雄鼠的运动能力及抑郁样行为，而0.5、1.0、和2.0 h的ARS能使CD1雄鼠产生明显的焦虑样行为。本研究的不足之处在于仅探讨了ARS对雄性CD1小鼠行为学表现的影响，而未深入探讨其生理机制。未来的研究可以进一步探讨ARS对CD1雄鼠神经递质、内分泌、免疫系统等的影响，以更加全面地了解ARS的作用机制。总之，本实验结果为后续深入研究ARS诱导的焦虑所涉及神经环路及作用机制提供了重要的实验依据，并为雄性CD1小鼠急性应激诱导焦虑模型提供了有效的实验方案。
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