2023, Vol. 59
2. 青岛大学附属医院重症医学科
急性肺损伤(ALI)/急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是指肺泡上皮及肺毛细血管内皮弥漫性水肿损伤的危急重症[1-2]。ALI/ARDS预后较差[3]，脓毒症是导致ALI/ARDS的常见原因，革兰阴性杆菌中脂多糖(LPS)是导致感染的主要成分[4]。肺泡上皮细胞是ALI发生的靶细胞[5]，上皮细胞可以内吞LPS从而激活炎症[6]。因此，研究LPS诱导的肺部上皮细胞损伤的再生修复是ALI/ARDS早期治疗的新思路[7]。骨髓间充质干细胞(BMSC)可能通过多种机制促进肺损伤修复[8-10]。BMSC表达血清淀粉样蛋白A1(SAA1)可以改善LPS诱导的肺损伤，分泌角质细胞生长因子(KGF)[11-12]，降低内毒素、炎症因子水平[13-14]。晚期糖基化终末产物受体(RAGE)具有多种配体，应用阻断细胞表面RAGE的抗RAGE单抗或可溶性RAGE均有修复ALI/ARDS肺损伤的作用[15-16]。但目前BMSC旁分泌KGF对RAGE的调节，以及对ALI/ARDS肺上皮细胞的保护作用尚未明确，本文对此进行了实验研究，以期为ALI/ARDS治疗提供新思路。现将结果报告如下。
1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验细胞小鼠肺上皮细胞MLE12和小鼠骨髓间充质干细胞(mBMSC)均购自美国模式培养物集存库(ATCC)。本研究经青岛大学医学院实验伦理委员会批准。
1.1.2 主要试剂DMEM培养液、胎牛血清、DMEM/F12 1∶1培养液、双抗(链霉素及青霉素溶液)和胰蛋白酶购自美国GIBCO BRL公司；LPS购自美国Sigma-Aldrich公司；小鼠角质细胞生长因子-7(KGF7)酶联免疫试剂盒、小鼠默克可酶联免疫试剂盒购自中国Elabscience公司；抗小鼠RAGE多克隆抗体购自美国R&D Systems公司；小鼠KGF购自以色列ProSpec公司；RAGE抗体、闭锁小带蛋白-1(ZO-1)抗体购自英国Abcam公司。MSC培养液是含体积分数0.10胎牛血清和体积分数0.01双抗的DMEM/F12 1∶1培养液；MLE12培养液是含体积分数0.02胎牛血清和体积分数0.01双抗的DMEM/F12 1∶1培养液。
1.2 实验方法 1.2.1 LPS诱导MLE12细胞损伤模型构建应用胰蛋白酶消化MLE12细胞，调整细胞密度为1×107/L，然后向培养液中加入100 μg/L的LPS构建MLE12细胞损伤模型[17]，观察MLE12细胞的形态、生长情况及存活率。
1.2.2 mBMSC与MLE12细胞体外间接共培养实验模型构建分别将mBMSC细胞、MLE12细胞消化，并用不含血清的DMEM培养液重悬，调整两种细胞密度均为1×107/L。将1.5 mL的mBMSC细胞悬液，接种在六孔板每孔底部的载玻片上，将六孔板放入37 ℃的CO2培养箱中孵育待细胞贴壁。然后在六孔板每孔中放入直径24 mm、孔径0.4 μm的Transwell小室，将1 mL MLE12细胞悬液接种在Transwell小室中与mBMSC细胞共培养。将六孔板放入37 ℃的CO2培养箱中孵育待细胞贴壁，然后加入LPS(100 μg/L)或等量的生理盐水干预1 d或7 d。观察细胞的形态、生长情况及存活率。
1.2.3 实验分组实验共分6组。control组：MLE12细胞单独培养，加入等量生理盐水；LPS组：MLE12细胞加入LPS(100 μg/L)孵育；MSC-control组：MLE12细胞与MSC间接共培养，加入等量生理盐水；MSC-LPS组：MLE12细胞与MSC间接共培养，加入LPS(100 μg/L)孵育；KGF组：MLE12细胞加入LPS(100 μg/L)孵育，同时加入KGF(10 μg/L)；anti-RAGE组：MLE12细胞与MSC共培养，加入LPS(100 μg/L)孵育，同时加入抗RAGE抗体(10 mg/L)。
1.2.4 酶联免疫吸附试验(ELISA)和蛋白质印迹(Western blot)法检测蛋白表达水平各组细胞接种在六孔板中，培养1、7 d后收集不同时间点的培养液，使用酶标仪(Bio-Rad，美国)，采用ELISA法测定各组细胞条件培养液中KGF及RAGE蛋白含量；收集各组以及小室下层的MLE12细胞，采用Western blot法测定MLE12细胞表面的RAGE(一抗1/1 000，acbam，批号ab216329)及ZO-1(一抗1/1 000，acbam，批号ab276131)蛋白含量，二抗均为山羊抗兔IgG(1/2 000，acbam，ab6721)。
1.3 统计分析采用SPSS 17.0统计学软件进行统计分析。计量资料以x±s表示，多组均数的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Bonferroni法，每组内7 d与1 d结果比较采用配对t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 BMSC对LPS损伤上皮细胞ZO-1蛋白表达的影响单因素方差分析结果显示，1 d时6组ZO-1的表达差异有统计学意义(F=172.40，P < 0.001)，两两比较结果显示，除control组与MSC-control组、MSC-LPS组比较差异无统计学意义(P>0.05)外，其余两两比较差异均有统计学意义(P < 0.05)。7 d时6组ZO-1的表达比较差异有统计学意义(F=146.80，P < 0.001)，两两比较结果显示，除control组与LPS组、MSC-control组与MSC-LPS组比较差异无统计学意义(P>0.05)外，其余两两比较差异均有统计学意义(P < 0.05)。除anti-RAGE组下降外(t=9.34，P < 0.05)，7 d时其余各组ZO-1表达均较1 d时升高(t=14.91~67.40，P < 0.05)。见图 1。
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| A、B：1 d时ZO-1水平Western blot检测结果；C、D：7 d时ZO-1水平Western blot检测结果。n=3，*P < 0.05。 图 1 BMSC对LPS损伤MLE12细胞ZO-1表达的影响 |
单因素方差分析结果显示，1 d时6组的KGF表达差异有统计学意义(F=45.51，P < 0.001)，两两比较结果显示，除MSC-LPS组与control组、LPS组比较以及control组与LPS组比较差异无统计学意义(P>0.05)外，其余两两比较差异均有显著性(P < 0.05)。7 d时，6组的KGF表达差异有统计学意义(F=2 359.00，P < 0.001)，任意两组间差异均有统计学意义(P < 0.05)。除control组外，7 d时其余各组KGF水平与1 d时比较差异均有统计学意义(t=14.87~73.25，P < 0.05)，control组、MSC-LPS组7 d时的KGF水平较1 d时下降。见图 2。
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| A、B分别为1、7 d时各组KGF表达水平比较；n=3，*P < 0.05。 图 2 BMSC对LPS损伤MLE12细胞条件培养液中KGF表达的影响 |
单因素方差分析，1 d时6组的RAGE表达差异有统计学意义(F=49.90，P < 0.001)，两两比较结果显示，除MSC-control组与KGF组比较差异无显著性(P>0.05)外，其余各组间比较差异均有显著性(P < 0.05)。7 d时6组的RAGE表达比较差异有显著性(F=275.60，P < 0.001)，任意两组间的差异均有显著性(P < 0.05)。除anti-RAGE组外，其余各组7 d时RAGE水平均较1 d时升高(t=17.20~57.84，P < 0.05)。见图 3。
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| A、B：1 d时RAGE水平Western blot检测结果；C、D：7 d时RAGE水平Western blot检测结果。n=3，*P < 0.05。 图 3 BMSC对LPS损伤MLE12细胞RAGE表达的影响 |
单因素方差分析显示，1 d时6组的RAGE表达差异有统计学意义(F=233.00，P < 0.001)，两两比较结果显示，除control组与MSC-control组、MSC-LPS组与anti-RAGE组比较差异无统计学意义(P>0.05)外，其余各组间比较差异均有统计学意义(P < 0.05)。7 d时6组RAGE表达水平差异有统计学意义(F=228.20，P < 0.001)，两两比较结果显示，除control组与MSC-LPS组、control组与KGF组、MSC-LPS组与KGF组比较差异无统计学意义(P>0.05)外，其余各组间比较差异均有统计学意义(P < 0.05)。除LPS组外，其余各组7 d时RAGE水平与1 d时比较差异均有统计学意义(t=11.02~27.08，P < 0.05)，MSC-LPS组7 d时的RAGE水平较1 d时升高，其余各组RAGE水平均下降。见图 4。
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| A、B分别为1、7 d时各组RAGE水平的比较；n=3，*P < 0.05。 图 4 BMSC对LPS损伤MLE12细胞条件培养液中RAGE表达的影响 |
ALI/ARDS通过多种机制导致炎症反应失调，且肺泡上皮及肺毛细血管内皮弥漫性损伤，在重症监护危急重症病人中的发病率为10%，病死率为40%[18]。HUANG等[19]报道，轻度和重度ARDS病人的患病率为9.7%和47.4%。该病目前尚无有效治疗药物，创新ARDS的治疗方案迫在眉睫。维持肺泡上皮细胞的数量和功能，促进受损肺泡上皮细胞的有效修复是ARDS治疗的关键。其中，ALI/ARDS的毛细血管通透性改变主要是由于紧密连接的破坏，细胞紧密连接组成包括Claudin蛋白家族以及ZO-1。
WONG等[20]应用MSC治疗肺损伤模型动物，发现MSC可定向迁移至肺上皮损伤部位，转化为肺上皮细胞，参与损伤气道的修复。肺上皮屏障破坏与紧密连接关键蛋白的表达降低有关，其中ZO-1是构成细胞紧密连接的重要组成部分，ZO-1蛋白水平降低提示细胞通透性增加，紧密连接受损。本研究结果显示，MSC可以改善LPS诱导的损伤，提高ZO-1水平，在1 d时KGF、anti-RAGE对LPS损伤的肺上皮细胞有修复作用；7 d时，MSC对LPS诱导的MLE12细胞损伤有修复作用，可修复受损细胞ZO-1为主的紧密连接的细胞结构，在上皮细胞损伤后期MSC修复作用减弱，甚至有加重细胞损伤的风险，可能与修复相关的细胞因子分泌量不足、MSC恶性转化有关，MSC细胞与MLE12细胞之间的相互作用仍需要进一步探讨。KGF对LPS损伤的MLE12细胞具有更强的修复作用，anti-RAGE组ZO-1仅在1 d时具有显著表达差异，随着时间推移ZO-1表达平缓，推测抑制RAGE表达可能不是调节ZO-1的关键环节。
GALIACY等[21]证实，KGF通过多种机制参与细胞移植和损伤保护，对肺上皮修复有重要作用。GOOLAER等[22]研究发现，KGF可上调肺上皮细胞中钠通道的基因表达，从而增强Na+-K+-ATP酶活性，改善肺泡液体转运能力，改变受损肺泡上皮屏障的通透性从而修复受损细胞。本研究结果提示：MSC旁分泌KGF可能需要时间累积，可能与细胞种板密度、细胞之间的相互作用相关；anti-RAGE有利于分泌KGF从而发挥对肺上皮细胞的保护作用，而LPS刺激损伤肺上皮细胞的同时，随着时间增加可能也会影响MSC的旁分泌作用，从而降低KGF的分泌，对于MSC对KGF的调控存在正负调控，而其中anti-RAGE可促进KGF表达，可能参与肺保护作用；KGF可能参与LPS诱导的MLE12细胞损伤。SHAO等[23]发现，经KGF-2预处理后，油酸诱导的ALI大鼠中Claudin-5、ZO-1和血管内皮钙黏蛋白的表达增加，认为KGF-2可通过维持肺微血管内皮屏障来减轻油酸诱导的ALI[24]，其作用机制与下调Wnt/β-catenin信号通路中Wnt5a、β-catenin和抗原呈递细胞表达有关[23]。但也有研究结果表明，KGF对肺泡上皮细胞屏障功能的保护作用是由于增加顶端周围的F-actin环，通过调节肌动蛋白骨架增强肺泡屏障功能，而在实验中没有观察到Claudin和ZO-1水平的显著改变。
RAGE是具有多种配体的受体，与不同配体结合，激活的细胞内信号转导途径也不同[15]。RAGE的膜结合形式是炎症、代谢功能障碍和血管损伤的关键媒介[25]。有研究表明，阻断RAGE可以改善ALI的炎症反应[26]。抑制RAGE通过直接抑制肺泡上皮细胞的自噬凋亡来缓解LPS诱导的肺损伤[27]。但同时，循环的可溶性形式的RAGE已被证明是一种诱饵受体，是RAGE的天然拮抗剂，可能对阻塞性气道疾病的发展具有保护作用[26]。ZHANG等[28]发现，重组小鼠可溶性RAGE表达增加，使RAGE信号传递受到抑制，减少炎症因子释放，从而降低肺通透性并减轻细胞凋亡水平，最终改善LPS诱导的小鼠ALI。本研究发现，LPS诱导MLE12细胞炎症后会导致RAGE表达减少，MSC具有更强的分泌RAGE的能力，KGF也会促进RAGE分泌，anti-RAGE需要7 d后才可以达到抑制RAGE表达的效果；LPS损伤肺上皮细胞会导致培养液中RAGE含量降低，MSC可以增高RAGE含量，可以逆转LPS诱导的炎症反应，其机制可能与旁分泌KGF有关。在心肌梗死大鼠模型中发现，MSC可以分泌可溶性晚期糖基化终末产物，可以减少心肌梗死面积以及改善心肌纤维化，MSC具有修复LPS诱导损伤的MLE12细胞的功能，是治疗心肌梗死的潜在疗法[29]。
综上所述，BMSC通过旁分泌产生KGF，能早期减轻ALI/ARDS时肺泡上皮细胞的进一步炎症损伤，促进上皮细胞增殖，减少上皮间质转分化，从而维持ALI/ARDS时肺泡上皮细胞的数量和功能，促进肺泡上皮的修复，上皮细胞的RAGE可能是该调节作用的关键分子。BMSC治疗ALI/ARDS的机制还有待进一步的研究来探讨。
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