弥漫性胶质瘤是最常见的中枢神经系统恶性肿瘤，占中枢神经系统恶性肿瘤的80%^[1]。世界卫生组织(WHO)根据其组织学和分子特征将它们归类为Ⅰ~Ⅳ级^[2]。Ⅳ级胶质母细胞瘤(GBM)最具侵袭性，且中位生存期较差^[3]。p53被认为是一个关键的肿瘤抑制基因，其功能障碍对肿瘤发生具有重要影响^[4]。p53基因发生突变的肿瘤约占人类肿瘤的50%，一些p53突变体具有促进肿瘤发生发展的特性^[5]。缝隙连接由连接蛋白组成，连接蛋白是一种跨膜蛋白，可组装成质膜中的通道^[6]。缝隙连接信号负责相当大比例的细胞通讯，通过与相邻细胞形成的缝隙连接，可向邻近细胞递送和交换小分子肽、离子、内源核酸和其他细胞代谢物。因此，缝隙连接的异常表达可以改变细胞的新陈代谢，影响肿瘤的发生和进展^[7]。连接蛋白43(Connexin 43)是目前发现细胞膜上表达最丰富的连接蛋白^[8]。它能调节包括增殖在内的多种细胞功能活动^[9]，其表达异常会引起癌症等多种病理变化^[10]。有研究表明，Connexin 43可以促进胶质母细胞瘤的侵袭^[11]。但胶质母细胞瘤中p53突变和Connexin 43的调节关系目前尚不明确。本实验选用p53野生型的U87细胞^[12]和p53突变型的U251细胞^[13]，检测Connexin 43的表达，旨在探讨p53基因突变对胶质母细胞瘤细胞Connexin 43表达的影响。

1 材料与方法 1.1 实验材料

本实验所用细胞为人胶质母细胞瘤U87细胞与U251细胞，均为贴壁生长的细胞，其中U87细胞为p53野生型细胞，而U251细胞则为p53突变型细胞。高糖DMEM细胞培养液购于以色列Biological Industries公司，胎牛血清购于北京全式金生物技术有限公司，青链霉素合剂购于北京索莱宝公司，p53抗体、Connexin 43抗体和GAPDH抗体均购于美国CST公司，羊抗兔IgG-HRP购于上海爱必信生物科技有限公司。

1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养

将U87与U251细胞分别接种于含体积分数0.01青链霉素合剂和体积分数0.10胎牛血清的高糖DMEM培养液中，置于37 ℃、含体积分数0.05 CO₂的培养箱中培养，待细胞融合度达80%~90%时，用胰酶消化2~3 min，加入等量的完全培养液终止消化，收集到15 mL的离心管中，以1 000 r/min离心5 min后丢弃上清液，加入新的完全培养液，用吸管轻轻吹打50~80次后充分悬浮细胞，转移到新的培养瓶中进行培养。

1.2.2 Western blotting检测p53和Connexin 43蛋白的表达

将U87细胞和U251细胞悬液按照每孔1×10⁸/L的密度分别接种于6孔板中，待细胞融合度达到80%左右时将6孔板从培养箱中取出，每孔加入100 μL裂解液在冰上裂解30 min后提取两种细胞的蛋白。加入5×Loading Buffer，在水中煮沸10 min变性后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。每个凝胶孔的蛋白上样量为20 μg，用90 V的稳定电压进行电泳，用300 mA的稳定电流转膜90 min，根据所需目的蛋白的分子量对PVDF膜进行剪裁，然后以10 g/L的脱脂奶粉封闭90 min，分别加入p53抗体(1∶1 000)、Connexin 43抗体(1∶1 000)以及GAPDH抗体(1∶10 000)4 ℃孵育过夜。用TBST溶液漂洗3次(每次10 min)之后加入二抗(1∶10 000)室温孵育60 min，再用TBST溶液漂洗3次。用ECL化学发光液进行显影并拍照。使用Image J软件分析p53、Connexin 43和GAPDH条带的灰度值，目的蛋白的表达水平以p53、Connexin 43与GAPDH的比值表示。

1.3 统计学方法

利用GraphPad Prism软件对数据进行统计学分析，计量资料以x±s表示，两组比较采用两独立样本t检验，P < 0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 两种细胞中p53蛋白表达的比较

Western blotting结果显示，U87和U251细胞中p53蛋白的相对表达水平分别为1.280±0.227和0.570±0.080(n=6)。与U87细胞相比较，U251细胞中p53蛋白的表达水平明显降低，差异具有统计学意义(t=2.948，P < 0.05)。见图 1。

2.2 两种细胞中Connexin 43蛋白表达的比较

Western blotting检测结果显示，U87细胞和U251细胞中Connexin 43蛋白的相对表达水平分别为0.370±0.096和0.820±0.131(n=6)。与U87细胞相比较，U251细胞中Connexin 43蛋白的表达水平明显升高，差异具有统计学意义(t=2.771，P < 0.05)。见图 2。

3 讨论

胶质母细胞瘤是目前最常见和最具侵袭性的成人脑肿瘤，容易复发而且预后较差，5年生存率仅为5%^[14]，主要原因是由于肿瘤的广泛浸润、细胞异质性以及放化疗抗性^[15-17]。p53是如今研究最广泛的肿瘤抑制因子之一，它能调节各种细胞过程，包括细胞的侵袭与增殖^[18]。在正常情况下，p53的活性维持在基础水平，但这种活性可能会在不同的应激条件下增加，例如不同类型的DNA损伤和致癌性损伤^[19]。所以p53通路的失调被认为是肿瘤发生中的关键事件，在大多数的人类癌症中，p53出现下调或突变^[5]。

有研究表明，在人类前列腺癌细胞中，Connexin 43蛋白的表达随着肿瘤细胞恶性程度的增加而升高，其在肿瘤内的分布发生变化，并与细胞侵袭之间存在相关性^[20]。但也有研究发现，在胰腺导管腺癌细胞中，p53突变体可以通过促进Connexin 43蛋白的降解来增强细胞的迁移侵袭能力^[21]。而在胶质母细胞瘤细胞中，Connexin 43的表达增加可以增强细胞的侵袭能力，敲除U87细胞中的Connexin 43则会显著降低细胞的侵袭能力^[22]。因此，胶质母细胞瘤细胞中依赖于Connexin 43的细胞通讯，可能是促进胶质母细胞瘤侵袭的一个重要因素。本实验结果显示，与U87细胞相比，U251细胞中Connexin 43蛋白的表达显著升高，表明p53基因的突变可能会导致胶质母细胞瘤细胞中Connexin 43蛋白的表达升高。有研究显示，U251细胞在体内比U87细胞具有更强的侵袭性和浸润性^[23]，该特性是否与Connexin 43表达上调有关有待进一步研究。本研究后续将探讨p53突变调控Connexin 43的机制及与胶质瘤发展的关系，以期为靶向治疗胶质母细胞瘤提供实验数据。