2023, Vol. 59
2. 中国人民解放军海军第971医院;
3. 山东第一医科大学第一附属医院(山东省千佛山医院)检验科
白细胞介素2受体(IL-2R)是由α(CD25)、β(CD122)和γ(CD132)3个亚基组成的复合型的糖蛋白，其中IL-2Rα除可以表达于T淋巴细胞表面，也可以经蛋白水解酶酶切释放到血液中，以可溶性白细胞介素2受体(sCD25)存在[1-2]。目前研究发现, sCD25浓度检测在血液病、感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤以及器官移植等诊断、病情监测及治疗效果评价方面具有参考价值[1-10]。本文旨在建立流式微球分析(CBA)方法检测成人血清sCD25的正常值范围，为sCD25指标用于临床相关疾病研究和病情评估提供参考价值。
1 资料和方法 1.1 样本来源及分组样本来自青岛大学附属医院黄岛院区检验科, 为当天体检人群中筛选出的血清标本。样本筛选参考《临床实验室检验项目参考区间的制定》和《临床化学检验血液标本的收集与处理》规范[11]。纳入标准为：血常规及生化、肝肾功能各项指标均在正常参考值范围内；排除妊娠及有疾病史者；体检报告最终结论健康者。将收集的样本采用偏差法剔除离群样本，最后筛选出204例样本，年龄分布24~65岁，其中24~40岁(青年组)、41~65岁(中年组)各102例，两组男性、女性各51例。
1.2 试剂及仪器sCD25 LEGENDplexTM检测试剂盒购于美国BIOLEGEND公司；双激光四色流式细胞仪来自杭州艾森生物(Novo Cyte D2040R)；涡旋仪和振荡器来自美国赛洛捷克(SCILOGEX)。
1.3 CBA检测方法 1.3.1 样本预处理采集符合纳入标准的体检人群血清样本，使用无酶、低吸附、无热源的EP管分装(500 μL)，以1 000 r/min离心10 min，取样当天进行检测。
1.3.2 流式细胞仪样本检测模板建立首次使用sCD25 LEGENDplexTM检测试剂盒，需要在流式细胞仪上建立实验模板，绘制两张散点图和一张柱形图。①第一张散点图，横坐标、纵坐标分别设置为前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)，将空白微球涡旋混匀30 s后加入流式管中，在流式细胞仪采样的过程中，通过调节FSC和SSC的电压和增益将微球团块调节出来，并且使其清晰地位于散点图横纵坐标8×104~32×104之间的位置，通过圈门和设置阈值的方式降低杂信号对目标微球的干扰。将柱形图的横坐标设置成别藻蓝蛋白(APC)，用以显示E1门内成分。②第二张散点图参数设置：因试剂中使用APC和藻红蛋白(PE)荧光物质，故第二张散点图的横坐标、纵坐标分别设置为PE和APC，坐标轴采用对数函数的放大形式，将PE微球涡旋混匀30 s后加入流式管，在流式细胞仪采样的过程中，通过调节APC和PE的电压和增益，将APC和PE荧光强度的范围显示在散点图的横纵坐标10~106范围之内。③根据软件的分析要求，设置停止条件(事件数300个)并保存实验模板。
1.3.3 标准曲线和待测样本的制备将sCD25试剂盒恢复至常温(20~25 ℃)，根据说明书将250 μL的实验缓冲液加入标准品冻干粉瓶中，将标准品冻干粉充分溶解(液体澄清无肉眼可见颗粒)。根据试剂盒说明书中sCD25标准品浓度，设置标准品冻干粉溶解后sCD25浓度为50 000 ng/L。将sCD25最高浓度50 000 ng/L的标准品进行4倍梯度稀释，经过6次稀释，加上空白对照管，最后获得8个浓度梯度。将5 mL的实验缓冲液加入基质B冻干粉中，涡旋震荡使其完全溶解。
1.3.4 标准曲线及样本制备和分析① 向8支标准品流式管中分别加入25 μL的基质B溶液，样本管加入25 μL实验缓冲液。②向8支标准品流式管和样本管中分别加入25 μL浓度为1×的捕获微球抗体悬液。③分别吸取标准曲线8个浓度标准液25 μL，按浓度顺序加入8支流式管中，样本管中加入25 μL的待测样本(血清)。④上述步骤结束后，将所有流式管放在震荡器上，室温(20~25 ℃)、避光、200 r/min震荡2 h。⑤孵育2 h以后，向所有流式管中加入500 μL浓度为1×洗涤缓冲液(Wash Buffer)，涡旋流式管10 s后，将流式管置于室温离心机中以500 r/min离心5 min，弃上清。然后再向上述所有的流式管中分别加入25 μL的检测抗体，放在震荡器上以200 r/min，室温(20~25 ℃)避光震荡1 h。⑥孵育1 h后，分别向所有流式管中加入25 μL的PE，放在震荡器上以200 r/min，室温下避光震荡30 min。⑦避光孵育结束后，向所有流式管中加入500 μL的1×洗涤缓冲液(Wash Buffer)，涡旋流式管10 s之后，将流式管置于室温离心机中以1 500 r/min离心5 min，弃上清，加入150 μL的1×
洗涤缓冲液，将样本管涡旋20 s后，打开流式细胞仪的实验模板上机检测。⑧将上机结果导出3.0版本的FCS文件，再通过LEGEND plex V8.0分析软件来拟合标准曲线。
1.4 统计学处理使用SPSS 17.0软件进行统计学处理，符合正态分布的计量资料数据以x±s形式表示，数据间比较采用t检验，P < 0.05表示差异有统计学意义。采用x±1.96s方法计算血清sCD25双侧95%的正常参考值范围。
2 结果 2.1 不同年龄健康成人血清sCD25浓度比较青年组和中年组血清sCD25浓度差异无统计学意义(P>0.05)。见表 1。
| 表 1 不同年龄健康成人血清中sCD25浓度比较(n=102, x±s) |
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青年组和中年组男性和女性血清中sCD25浓度差异均无统计学意义(P>0.05)。见表 2。
| 表 2 相同年龄段不同性别健康成人血清中sCD25浓度比较(n=51, x±s) |
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青年组和中年组合计204例健康成人血清中sCD25的浓度呈正态分布，其平均值为(812.93±214.32) ng/L，SCD25浓度的95%双侧正常参考值范围为393.87~1 233.00 ng/L。
3 讨论sCD25作为免疫监测的重要指标，与多种疾病的诊断、治疗和预后关系密切。王颖超等[12]对儿童噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(HLH)外周血中sCD25的表达研究显示，血清sCD25表达水平对于HLH具有诊断意义。LUN等[10]研究显示，外周血sCD25浓度或可成为肝移植术后识别排斥的诊断指标。ZHANG等[1]研究表明，血清sCD25是系统性红斑狼疮病人疾病活动性的标志和肾脏疾病的预测指标。这些研究表明，人血清中sCD25的表达水平与多种疾病的发病、病情进展及治疗效果都具有密切的关系。因此，建立sCD25正常参考值在临床应用方面具有重要的意义。
CBA方法以微球作为载体，其免疫反应原理与“双抗夹心”或“三明治夹心”法相似[13-14]。CBA检测时，将捕获微球抗体与待测物质共同孵育后再加入生物素标记的检测抗体，从而形成“双抗夹心”复合物，再加入链霉素标记的PE荧光素，借助于链霉素和生物素结合的方式实现PE对检测抗体标记，应用流式细胞仪对检测抗体上标记的PE荧光信号进行检测，通过PE荧光强度可间接反映待测物的浓度[14]。近年来CBA方法在免疫指标检测领域正逐渐得到推广和使用。相比传统的免疫检测方法ELISA方法来说，CBA方法具备以下优势：样本制备步骤少，可减少人为操作步骤，降低人为操作失误[15]；CBA试剂批间和批内的变异系数小[13, 16-17]，精密度和准确度高；CBA方法检测灵敏度高而且线性范围广[14-15, 18]；检测所需的样本量少，只需要25~50 μL血清或者血浆, 样本容易获取而且适用范围广[14-15, 17, 19-20]；检测借助于流式细胞仪，无需配备专门的仪器，应用成本相对低[21]；样本制备时间短，可实现多指标同步检测，检测效率高, 更适用于临床样本等处理[13, 17-18]。
本文对成年健康人群血清中的sCD25检测显示，青年和中年人群sCD25浓度差异无统计学意义, 男性和女性sCD25浓度差异也无统计学意义, 成年健康人群血液中sCD25的95%正常参考值范围为393.87~1 233.00 ng/L。ZHANG等[1]应用ELISA方法检测92例年龄>16岁的健康人血液中sCD25的水平，结果显示其95%参考值为448.5~1 279.9 ng/L。本文检测结果显示，青年组和中年组204例健康成人血清中sCD25的95%双侧正常参考值范围(393.87~1 233.00 ng/L)与其结果相近。CABRERA等[8]应用ELISA方法对美国盖恩斯维尔市血库30例年龄不详、男女数量各半的正常血样检测显示，正常对照组sCD25数值为(2 953±378)ng/L，高于本文成年健康人群的sCD25数值。DOWNES等[22]应用ELISA方法检测来自Cambridge BioResource (CBR)的80例成年健康人血中sCD25平均值为3 356 ng/L，高于本文成年健康人群血清sCD25浓度。以上研究成年健康人血清中sCD25水平差异较大，原因除了检测方法差异外，可能主要是由于种族和地域差异较大所致。因此，建立和使用本地区成年健康人群sCD25参考区间对疾病辅助诊断和病情监测具有参考价值。
本文研究由于体检人群中未成年人群(＜18岁)和老年人群(>66岁)的样本较少, 未对未成年人和老年人群sCD25数据进行分析。有研究显示，老年人血液中sCD25浓度较其他年龄段人群高[23]。本文研究结果显示，不同性别和年龄正常人群血液中sCD25浓度差异无统计学意义，但是由于本文样本数量及人群分布所限，所得结论不能完全反映年龄及性别因素对健康人血清sCD25的影响。后续研究继续收集健康体检人群的样本，以对sCD25的正常参考值范围做进一步研究。
综上所述, 不同年龄段(青年组和中年组)健康成人血清中sCD25浓度差异无统计学意义，相同年龄段不同性别健康成人血清中sCD25浓度差异也无统计学意义；青年组和中年组204例健康成人血清中sCD25的95%双侧正常参考值范围393.87~1 233.00 ng/L。本文使用CBA方法检测sCD25的正常值范围，为sCD25指标在临床相关疾病研究和病情的判断方面初步奠定了基础。
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