鼻咽癌是起源于鼻咽黏膜上皮细胞的头颈部恶性肿瘤，其发病率居头颈部恶性肿瘤首位^[1-3]。鼻咽癌起病隐匿、早期症状不明显、发病位置狭窄，易被忽视且易扩散转移，大多数病人发现时已处于中晚期，严重影响了病人的预后^[4]。早发现早诊断，有利于鼻咽癌病人的治疗和预后。EB病毒(EBV)与鼻咽癌的发生密切相关，可以潜伏感染鼻咽部黏膜上皮细胞引发癌变，并刺激机体产生相应的抗体，如EBV衣壳抗原IgA(VCA-IgA)、早期抗原IgA(EA-IgA)、Rta蛋白IgG(Rta-IgG)等，这些抗体可作为鼻咽癌的血清学标志物，然而单个指标检测对鼻咽癌的血清学辅助诊断效能不理想，目前临床上多采用多个指标联合检测的方式^{[3, 5]}。应用荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)技术检测血清EBV-DNA载量能够提高鼻咽癌早期筛查的准确率，近年来逐渐引起重视^[6-8]。本研究在常用的鼻咽癌抗体标志物组合(VCA-IgA、EA-IgA、Rta-IgG)的基础上，联合检测血清EBV-DNA载量，以探讨血清EBV抗体和EBV-DNA联合检测在鼻咽癌治疗前诊断中的价值。现将结果报告如下。

1 资料与方法 1.1 研究对象

2019年12月—2020年12月，选取青岛大学附属医院住院及门诊确诊的鼻咽癌病人163例(鼻咽癌组)，其中男95例，女68例，年龄42~84岁，平均(63.39±8.90)岁。所有病例均经组织病理检查确诊为鼻咽癌，且未合并其他恶性肿瘤或器官衰竭，3个月内均未发生急性感染、急性心脑血管疾病及严重创伤，采血检验前均无手术、化疗、放疗及免疫治疗史。依据中国鼻咽癌2008临床TNM分期标准进行分期，其中Ⅰ~Ⅱ期70例(早期)，Ⅲ~Ⅳ期93例(晚期)。同期选取体检中心的140例健康体检者作为对照组，其中男73例，女67例，年龄为38~84岁，平均(62.45±9.77)岁；均排除鼻咽部疾病，且无心脑血管疾病、急性感染及严重创伤。两组的年龄及性别差异无统计学意义(P＞0.05)。

1.2 标本采集与检测

鼻咽癌病人均于入院后治疗前采集清晨空腹静脉血5 mL，体检者均于体检日采集清晨空腹静脉血5 mL，均以4 000 r/min离心10 min，分离血清。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测VCA-IgA、EA-IgA、Rta-IgG抗体水平，采用FQ-PCR法检测EBV-DNA载量，所有检测均严格按照仪器及配套试剂的说明进行操作。抗体阳性判断标准：VCA-IgA、EA-IgA以标本吸光度(A)值/校准品A值≥1.1为阳性；Rta-IgG以标本A值/临界值≥1为阳性，其中临界值根据说明书提供的方法计算。VCA-IgA、EA-IgA及Rta-IgG的结果以相对A值(rA)表示，rA=S/CO，S/CO为标本A值与cutoff值的比值。采用自动分析软件对FQ-PCR结果进行分析，EBV-DNA以＞5×10⁵ copies/L为阳性。联合检测采用平行试验(并联试验)方法，检测项目其中一项为阳性即判断为阳性。

1.3 统计学分析

使用SPSS 23.0统计学软件进行数据统计分析。符合正态分布的计量资料以x±s形式表示，组间比较采用成组t检验；不符合正态分布的计量资料以中位数(M)和四分位数间距(Q_U-Q_L)形式表示，组间比较采用秩和检验；计数资料以例数和百分数表示，组间比较采用χ²检验。根据血清EBV抗体和EBV-DNA检测结果绘制受试者工作特征(ROC)曲线，采用公式计算诊断灵敏度、特异度、准确度和曲线下面积(AUC)等指标^[9]。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 两组血清EBV抗体效价及EBV-DNA载量的比较

鼻咽癌组血清VCA-IgA、EA-IgA、Rta-IgG抗体效价和EBV-DNA载量水平及其阳性率均高于对照组，差异均有统计学意义(t=12.499~14.597，Z=12.893，χ²=51.274~153.132，P＜0.05)。结果见表 1、2。

2.2 血清EBV抗体和EBV-DNA检测对鼻咽癌的诊断价值

单项检测中，AUC最高的指标为EBV-DNA(0.930)，灵敏度最高的为VCA-IgA(78.53%)，特异度最高的为EBV-DNA(92.86%)，准确度最高的为EBV-DNA(84.49%)；联合检测中，AUC最高的指标为VCA-IgA+EA-IgA+Rta-IgG+EBV-DNA(0.992)，灵敏度最高的为VCA-IgA+EA-IgA+EBV-DNA以及VCA-IgA+EA-IgA+Rta-IgG+EBV-DNA(100.00%)，特异度最高的则为VCA-IgA+EA-IgA+EBV-DNA(65.00%)，准确度最高的为VCA-IgA+EA-IgA+EBV-DNA(83.83%)。见图 1和表 3。

2.3 不同分期鼻咽癌病人血清EBV抗体效价和DNA载量比较

Ⅲ~Ⅳ期鼻咽癌病人血清VCA-IgA、Rta-IgG抗体效价和EBV-DNA载量明显高于Ⅰ~Ⅱ期病人，差异均具有统计学意义(t=3.332、4.324，Z=10.507，P＜0.05)；Ⅲ~Ⅳ期鼻咽癌病人EBV-DNA阳性率明显高于Ⅰ~Ⅱ期病人，差异具有统计学意义(χ²=46.802，P＜0.05)，但不同分期鼻咽癌病人3项抗体阳性率比较差异无显著意义(P＞0.05)。见表 4、5。

3 讨论

近年来，鼻咽癌的发病率逐年升高，在我国其发病率和死亡率均高于世界平均水平^{[4, 10]}。EBV是可引起人类B淋巴细胞感染的疱疹病毒，与鼻咽癌的发生发展密切相关。机体感染EBV产生的多种特异性抗体，如VCA-IgA、EA-IgA、Rta-IgG等，具有不同的临床意义，它们在不同鼻咽癌病人血清中的滴度有一定差异，且其血清水平与病人病情密切相关^[5]。

VCA-IgA和EA-IgA检测在鼻咽癌筛查及辅助诊断中已有较多应用。Rta蛋白是EBV裂解期BRLF1基因突变表达的一种编码蛋白，能诱导促进鼻咽部上皮细胞分裂发生癌变，是目前备受关注的新分子靶标，检测EBV Rta-IgG有助于早期鼻咽癌的辅助诊断^[10]。国内外已经有不少研究证实了Rta-IgG与VCA-IgA、EA-IgA联合检测在鼻咽癌早期诊断中的潜在价值^[11-12]。EBV感染机体后可潜伏在淋巴细胞内，并以环状DNA的形式游离于细胞质中，因此检测EBV-DNA拷贝数可反映病人体内EBV载量^[13-14]。

本文研究结果显示，鼻咽癌组血清VCA-IgA、EA-IgA、Rta-IgG抗体效价和EBV-DNA载量及其阳性率均显著高于健康对照组，提示该4项指标可用于鼻咽癌的辅助诊断。进一步分析这4项指标的诊断价值，单项检测中AUC最大的为EBV-DNA(0.930)，其诊断效能最优，且其诊断特异度及准确度也最高，但诊断灵敏度低于VCA-IgA。因此，在临床筛查鼻咽癌时各项标志物常采用联合检测且并联试验的方法，以提高诊断的阳性率。本文研究结果显示，联合检测可明显提高诊断效能，4项指标联合检测的AUC及灵敏度均最高，常规两种抗体和EBV-DNA检测组合VCA-IgA+EA-IgA+EBV-DNA的AUC、灵敏度及特异度也明显高于单纯抗体组合VCA-IgA+EA-IgA+Rta-IgG，表明VCA-IgA+EA-IgA+Rta-IgG+EBV-DNA联合检测在临床筛查鼻咽癌时具有较好的应用潜力。

目前，EBV抗体效价与鼻咽癌临床分期的相关研究较多，但结果存在一定的争议^[15]。而EBV-DNA拷贝数的检测可以更直观地体现机体内EBV的含量，为探究EBV载量与鼻咽癌分期的关系提供了便利。本研究初步探讨了163例鼻咽癌病人3种EBV抗体和EBV-DNA与鼻咽癌病人TNM分期的关系，结果显示，Ⅲ~Ⅳ期鼻咽癌病人血清VCA-IgA、Rta-IgG抗体效价和EBV-DNA载量明显高于Ⅰ~Ⅱ期病人，并且EBV-DNA阳性率也明显高于Ⅰ~Ⅱ期病人，但其他3项指标的阳性率在早期和晚期病人中无统计学差异。以往的研究已经证实，VCA-IgA阳性提示病毒大量复制，而EA-IgA阳性提示病毒进入复制阶段^[16]。因此，与EA-IgA相比较，血清VCA-IgA滴度变化更为明显。随着临床分期的升高，鼻咽癌会刺激EBV编码蛋白的高表达，Rta蛋白表达也会增高，进而使得相应抗体效价增高^{[11, 17]}。因此，晚期鼻咽癌病人血清中的Rta-IgG水平明显高于早期病人。随着病情的恶化，肿瘤细胞释放到外周血可引起病人血清中EBV-DNA拷贝数的增加^[1]。因此，EBV-DNA拷贝数与肿瘤分期呈正相关性。今后的研究中，我们将扩大样本量，在根据检测结果区分不同分期的病人时重新计算截断值，并进一步分析各项标志物区分不同分期鼻咽癌病人的诊断价值。

综上所述，相较于单一的EBV抗体检测，联合检测可提高诊断效能，并且在初筛时3项抗体联合EBV-DNA检测更为理想，有利于病人的早期诊断、病情判断及个性化治疗方案的及时制定，在鼻咽癌病人辅助诊断和治疗中具有一定的临床价值。