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  青岛大学学报(医学版)  2022, Vol. 58 Issue (5): 726-729   DOI: 10.11712/jms.2096-5532.2022.58.162
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基金项目

青岛市医疗卫生优秀人才培养项目资助

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冷喆, 孙娴莉, 林慧, 等. 不明原因稽留流产绒毛组织E-CAD/CK7/PLAC8表达[J]. 青岛大学学报(医学版), 2022, 58(5): 726-729.   DOI: 10.11712/jms.2096-5532.2022.58.162
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LENG Zhe, SUN Xianli, LIN Hui, et al. EXPRESSION OF E-CAD/CK7/PLAC8 IN CHORION TISSUE OF UNEXPLAINED MISSED ABORTION[J]. Journal of Qingdao University(Medical Sciences), 2022, 58(5): 726-729.   DOI: 10.11712/jms.2096-5532.2022.58.162
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作者简介

冷喆(1996-)，男，硕士研究生.

通讯作者

黄煜(1972-)，女，博士，教授，博士生导师。E-mail：huangyuqd@126.com.

文章历史

收稿日期：2022-04-06
修订日期：2022-06-20
Contents              Abstract              Full text              Figures/Tables              PDF
不明原因稽留流产绒毛组织E-CAD/CK7/PLAC8表达
冷喆 , 孙娴莉 , 林慧 , 常晓彤 , 宋黄贝 , 黄煜     
青岛大学附属妇女儿童医院妇科中心, 山东 青岛 266000
收稿日期：2022-04-06；修订日期：2022-06-20
基金项目：青岛市医疗卫生优秀人才培养项目资助
作者简介：冷喆(1996-)，男，硕士研究生.
通讯作者：黄煜(1972-)，女，博士，教授，博士生导师。E-mail：huangyuqd@126.com.
摘要：目的 探讨E-钙黏蛋白(E-CAD)、细胞角蛋白7(CK7)和胎盘特异性蛋白8(PLAC8)在不明原因稽留流产绒毛组织中的表达及其可能的意义。方法 选取早孕期不明原因稽留流产病人20例(稽留流产组)、非计划妊娠行人工流产的正常早孕女性20例(正常妊娠组)作为研究对象，采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测绒毛组织中E-CAD、CK7及PLAC8的mRNA表达，Western Blot及免疫组织化学方法检测绒毛组织中E-CAD、CK7及PLAC8的蛋白表达。结果 稽留流产组绒毛组织中E-CAD、CK7的mRNA和蛋白表达均明显高于正常妊娠组(t=3.995~12.200，P < 0.01)，两组PLAC8的mRNA和蛋白表达差异无显著性(P>0.05)。E-CAD以及CK7的阳性染色主要定位于滋养层细胞的细胞膜，PLAC8的阳性染色主要定位于合体滋养层细胞的细胞核，稽留流产组绒毛组织中E-CAD、CK7的平均光密度值(AOD)明显高于正常妊娠组(t=3.823、3.889，P < 0.05)，两组PLAC8的AOD差异无显著性(P>0.05)。结论 绒毛组织E-CAD、CK7表达升高可能与不明原因稽留流产的发生有关。
关键词：钙黏蛋白    角蛋白7    胎盘特异性蛋白8    流产，稽留    
EXPRESSION OF E-CAD/CK7/PLAC8 IN CHORION TISSUE OF UNEXPLAINED MISSED ABORTION
LENG Zhe , SUN Xianli , LIN Hui , CHANG Xiaotong , SONG Huangbei , HUANG Yu     
Department of Gynaecology, Qingdao Women and Children's Hospital Affiliated to Qingdao University, Qingdao 266000, China
ABSTRACT: Objective To investigate the expression of E-cadherin (E-CAD), cytokeratin 7 (CK7), and placental-specific protein 8 (PLAC8) in chorion tissue of unexplained missed abortion and their possible significance. Methods A total of 20 patients with unexplained missed abortion in early pregnancy were enrolled as missed abortion group, and 20 women with normal early pregnancy who underwent induced abortion due to unplanned pregnancy were enrolled as normal pregnancy group. Quantitative real-time PCR was used to measure the mRNA expression of E-CAD, CK7, and PLAC8 in chorion tissue, and Western Blot and immunohistochemistry were used to measure the protein expression of E-CAD, CK7, and PLAC8 in chorion tissue. Results Compared with the normal pregnancy group, the missed abortion group had significantly higher mRNA and protein expression levels of E-CAD and CK7 in chorion tissue (t=12.200, 9.968;P < 0.01), and there was no significant difference in the mRNA and protein expression levels of PLAC8 between the two groups (t=8.447, P>0.05). The positive staining of E-CAD and CK7 was mainly localized in the cell membrane of trophoblast cells, and the positive staining of PLAC8 was mainly localized in the nucleus of syncytiotrophoblast cells. Compared with the normal pregnancy group, the missed abortion group had a significantly higher average optical density (AOD) of E-CAD and CK7 in chorion tissue (t=3.823, 3.889;P < 0.05), and there was no significant difference in the AOD of PLAC8 between the two groups (P>0.05). Conclusion Increases in the expression of E-CAD and CK7 in chorion tissue may be associated with the occurrence of unexplained missed abortion.
KEY WORDS: cadherin    keratin-7    placental specific-8    abortion, missed    

稽留流产表现为胚胎或者胎儿的发育停滞[1]。目前约有50%的稽留流产原因不明，寻找对妊娠结局具有预测价值的生物学指标具有重要意义。E-钙黏蛋白(E-CAD)是一种肿瘤抑制蛋白，在调节多种生理功能方面发挥着重要的作用，而这些功能的失调可能导致癌症的发生[2]。细胞角蛋白7(CK7)是一种低分子量的细胞角蛋白，其主要功能是维持上皮组织的完整性和连续性[3]。胎盘特异性蛋白8(PLAC8)是一种分子量为16 000的蛋白质，又称为Onzin，从两栖动物到人类都高度保守。本研究初步探讨E-CAD、CK7以及PLAC8在稽留流产中作为生物学指标的潜能。

1 材料与方法 1.1 组织样本的收集

2020年11月—2021年1月，选取我院妇科就诊的早孕稽留流产病人(稽留流产组)及非计划妊娠行人工流产的正常早孕女性(正常妊娠组)各20例，年龄18~40岁。根据《妇产科学》第9版[4]的标准诊断正常早孕与稽留流产。排除标准：夫妻双方染色体异常，内分泌紊乱，生殖系统畸形，生殖道感染，免疫功能障碍，血栓前状态，严重的慢性疾病，接受过绒毛膜促性腺激素(HCG)保胎治疗。绒毛组织从子宫取出后立刻用无菌生理盐水冲洗，每份标本分成3部分，一部分置于RNA稳定保存液中，4 ℃保存；一部分置于-80 ℃冷冻保存；另一部分置于40 g/L多聚甲醛中，4 ℃固定。两组年龄、妊娠时间和妊娠次数差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究经我院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 RNA的提取以及实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)

使用MolPure Cell/Tissue Total RNA Kit(翌圣生物科技(上海)股份有限公司产品)提取绒毛组织总RNA，应用紫外线分光光度计测定RNA浓度及纯度，用逆转录试剂盒(Roche，巴塞尔，瑞士)将总RNA逆转录成cDNA，操作严格按照说明书进行。根据SYBR Green qPCR Mix(翌圣生物科技(上海)股份有限公司产品)说明书的方法行qRT-PCR，PCR引物及其序列见表 1。应用2－△△CT方法计算E-CAD、CK7以及PLAC8的mRNA表达，以GAPDH作为管家基因进行归一化处理。结果以目的基因与GAPDH的比值表示。

表 1 qRT-PCR引物及其序列
1.3 Western Blot检测

应用含有10 g/L蛋白酶以及磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液(上海雅酶生物医药科技有限公司)从绒毛组织中提取总蛋白，使用BCA试剂盒(上海雅酶生物医药科技有限公司)测定蛋白浓度，总蛋白经125 g/L SDS-PAGE凝胶电泳分离后转移至PVDF膜，加入50 g/L脱脂奶粉室温封闭2 h后，加入一抗, 4 ℃孵育8~10 h, TBST洗涤，加入相应二抗室温孵育2 h，洗涤，用ECL试剂盒(上海雅酶生物医药科技有限公司)检测蛋白表达，以β-Actin作为内参对照。

1.4 免疫组化染色

将绒毛组织加入40 g/L多聚甲醛4 ℃固定过夜，石蜡包埋，切5 μm厚度的切片，使用二甲苯及梯度浓度的乙醇(体积分数1.0~0.7)进行脱蜡及复水，然后将切片浸入0.01 mol/L枸橼酸缓冲液中，微波炉中进行抗原修复，采用免疫组化SP法进行染色，操作过程严格按照通用SP试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)说明书进行。用PBS代替一抗作为阴性对照。使用Olympus DP80显微镜获取切片图像，Image J软件分析图像的累积光密度值及阳性染色面积，计算平均光密度值(AOD，累积光密度值/阳性染色面积)。

1.5 统计学处理

应用Graphpad Prism 9软件进行统计学分析。计量资料结果以x±s表示，两组间比较采用两独立样本均数比较的t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 两组绒毛组织中E-CAD、CK7以及PLCA8的mRNA表达比较

qRT-PCR检测显示，稽留流产组绒毛组织中E-CAD、CK7的mRNA表达明显高于正常妊娠组(t=12.200、9.968，P < 0.01)，而两组PLAC8的mRNA水平差异无显著性(P>0.05)。见表 2。

表 2 两组绒毛组织E-CAD、CK7、PLAC8 mRNA和蛋白表达比较(n=20, x±s)
2.2 两组绒毛组织中E-CAD、CK7以及PLAC8蛋白表达比较

Western Blot检测结果显示，稽留流产组绒毛组织中E-CAD、CK7蛋白表达水平明显高于正常妊娠组(t=3.995、7.603，P < 0.01)，而两组PLAC8的蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图 1和表 2。

G1、G2、G3为正常妊娠组，M1、M2、M3为稽留流产组。 图 1 两组绒毛组织中E-CAD、CK7以及PLAC8蛋白表达的Western Blot检测
2.3 两组绒毛组织中E-CAD、CK7以及PLAC8的蛋白表达和定位比较

免疫组化检测结果显示，E-CAD以及CK7阳性染色主要定位于合体滋养层细胞和细胞滋养层细胞的细胞膜，PLAC8阳性染色主要定位于合体滋养层细胞的细胞核(图 2)。稽留流产组绒毛组织中E-CAD、CK7的AOD明显高于正常妊娠组，差异有显著性(t=3.823、3.889，P < 0.05)，两组PLAC8的AOD差异无显著性(P>0.05)。见表 3。

DAB染色，200倍。 图 2 两组绒毛组织中E-CAD、CK7及PLAC8的免疫组化检测

表 3 两组绒毛组织3个指标AOD比较(n=20, x±s)
3 讨论

稽留流产是妊娠中常见的并发症之一，目前已经明确了稽留流产的几个原因。但是，仍有50%的稽留流产原因不明。目前没有能够有效预测稽留流产的临床指标，因此，寻找能够预测妊娠结局的特异性强、灵敏度高的临床指标具有重要的意义。本文研究比较早孕期不明原因稽留流产病人及正常早孕女性绒毛组织中E-CAD、CK7以及PLAC8的表达水平，探讨其作为预测妊娠结局的生物学标志物的潜能。

众所周知，上皮-间充质转化(EMT)是一种细胞失去上皮特性而获得间充质特性并伴有转移的细胞过程[5]。E-CAD的丢失和波形蛋白的获得被认为是EMT过程中的重要事件[6]。EMT可以由多种诱导因子的复杂相互作用触发，如转化生长因子β(TGF-β)或者成纤维细胞生长因子(FGF)、多种受体酪氨酸激酶(RTKs)、WNT/β-catenin、NOTCH和HEDGEHOG信号通路[7]、EMT诱导转录因子(TFs)的激活、microRNAs，以及表观遗传和翻译后修饰[8]。当机体在炎症、伤口愈合和癌变等病理情况下EMT也可被激活[9]。有研究显示，E-CAD存在于母胎界面的滋养细胞以及蜕膜上皮细胞，可能与胚胎着床、滋养细胞分化及侵袭等生物学行为密切相关[10]。

在人类妊娠过程中，关键的环节是胚胎在子宫内膜中植入以及建立一个功能完备的胎盘，滋养层细胞对母体蜕膜的侵袭在其中发挥了重要作用。滋养层细胞是妊娠早期胎盘和胎儿发育的重要组成部分[11]，其从黏附依赖的上皮表型分化为间充质样的侵袭性绒毛外滋养层细胞，在母胎界面的发育中至关重要[11]。本文研究结果显示，不明原因稽留流产病人的E-CAD表达水平明显高于正常对照组，提示不明原因稽留流产胚胎绒毛滋养层细胞的细胞间黏附增加，导致滋养层细胞对母体蜕膜的侵袭减少，可能导致母体子宫螺旋动脉重构不足，最终导致不良妊娠结局的发生。因此，深入研究滋养层细胞对母体蜕膜的侵袭行为的调控机制具有重要意义。E-CAD表达水平的增加是通过何种方式影响滋养层细胞的侵袭性还有待进一步发掘。

细胞角蛋白具有极高的组织分化特异性和保守性，与上皮细胞的类型、增殖、分化密切相关，因此常被用作肿瘤细胞的标记物[12]。在宫颈上皮内瘤变中，CK7阳性表达是病变进展的一个标志[13]。然而，尽管有许多CK7在肿瘤进展以及预后预测中的作用研究，但在稽留流产中作用报道相对较少。本研究结果显示，不明原因稽留流产病人的绒毛组织中CK7的表达水平明显高于正常对照组，提示CK7的高表达可能是导致稽留流产的一个重要原因。

PLAC8已被证实参与各种细胞过程。PLAC8在妊娠和胎盘发育过程中的表达是动态的，并以植入依赖的方式积累。本文研究结果显示，不明原因稽留流产病人绒毛组织中PLAC8的mRNA及蛋白表达水平与正常对照者比较，差异无统计学意义。CHANG等[14]研究显示，PLAC8是间质性绒毛膜外滋养层细胞(iEVT)的标志物。考虑到iEVT主要定植于母体蜕膜，PLAC8可能在不明原因稽留流产病人与正常早孕女性的蜕膜组织中会有差异表达，有待进一步研究。

综上所述，不明原因稽留流产病人绒毛组织中的E-CAD以及CK7表达上调，这可能有助于开发稽留流产新的诊断和治疗策略，同时提示了稽留流产潜在的研究方向。

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