帕金森病(PD)是一种常见的神经退行性疾病^[1]。有研究表明，神经炎症在PD中发挥重要作用^[2]。星形胶质细胞是哺乳动物脑内分布最广泛的一类细胞^[3]。生理状态下，星形胶质细胞参与血-脑脊液屏障的生成和维持，分泌神经营养因子来调节突触发生、神经元分化和神经元存活，通常以胶质纤维酸性蛋白(GFAP)作为活化标志物^[4]。病理状态下，星形胶质细胞可由静息状态转变为激活状态，加剧或减弱损伤^[5-6]。根据作用的不同，可将星形胶质细胞分为具有促炎作用的A1型和具有抗炎作用的A2型^[7]。补体成分3(C3)在A1型星形胶质细胞中高表达，可以作为A1型细胞的标志物，同理Pentraxin 3(PTX3)可以作为A2型细胞的标志物^[7-9]。中枢神经系统存在包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)在内的多种细胞因子，对星形胶质细胞具有复杂的影响。本实验旨在研究经细胞因子TNF-α处理后星形胶质细胞的激活表型，探讨TNF-α在星形胶质细胞激活中的作用。

1 材料和方法 1.1 实验材料

原代培养的星形胶质细胞(从出生24 h以内的大鼠乳鼠中脑获取)，DMEM/F1基础培养液、胰蛋白酶(美国Hyclone公司)，胎牛血清(PBS，中国依科赛生物科技(太仓)有限公司)，青霉素-链霉素溶液、CCK-8试剂盒(中国北京索莱宝科技有限公司)，D-多聚赖氨酸、大鼠TNF-α(美国Sigma公司)，大鼠GAPDH、C3、PTX3基因引物(Takara公司，引物序列见表 1)，一步法总RNA提取试剂Trizol(Invitrogen公司)，逆转录试剂盒(美国赛默飞公司)，荧光定量PCR试剂盒(德国QIAGEN公司)。

1.2 星形胶质细胞的原代培养

实验前将实验器具高压灭菌。150 cm²细胞培养瓶用D-多聚赖氨酸处理过夜，再用高压灭菌去离子水清洗3次备用。取两个玻璃培养皿，每皿中加入10~15 mL基础培养液，置于冰上。取出生24 h内大鼠乳鼠，用体积分数0.75医用乙醇消毒，断颈取头，在解剖显微镜下用眼科剪和眼科镊取中脑置培养皿中，先后使用1 000 μL和200 μL移液枪将组织块轻轻吹打至消散，加3 mL胰蛋白酶吹打约10次，加3.5 mL完全培养液终止消化，将其吸至50 mL离心管中，以1 000 r/min离心5 min。弃上清，用完全培养液重悬沉淀，将其接种于培养瓶中，置37 ℃、含体积分数0.05 CO₂的培养箱中培养。培养14 d后，将细胞培养瓶封口后固定于空气浴恒温摇床上，以220 r/min剧烈振荡16 h。弃上清液，每个培养瓶中加入10 mL胰蛋白酶，置于37 ℃消化1 min，再加入等量完全培养液终止消化，使用一次性灭菌塑料吸管将培养瓶底部的细胞吹打下来，将培养液收集到离心管中，以1 000 r/min离心5 min。弃上清，加入完全培养液重悬沉淀，将细胞接种于孔板或培养瓶中。

1.3 CCK-8法检测TNF-α对星形胶质细胞活性的影响

TNF-α浓度梯度分别为0、5、10、20、40、80 μg/L，实验操作与数据处理按照试剂盒说明书进行。

1.4 实验分组及处理

实验分为对照组和TNF-α处理组。将原代培养的星形胶质细胞接种于6孔板中，每孔2 mL细胞悬液；第2天分组处理细胞，将两组细胞培养液均换成基础培养液，TNF-α处理组用TNF-α(10 μg/L)处理，置于37 ℃、含体积分数0.05 CO₂的培养箱中孵育24 h。

1.5 实时荧光定量PCR(qPCR)检测C3和PTX3 mRNA表达

向6孔板每孔中加入1 mL Trizol，冰上静置5 min，用1 mL枪头吹打贴附在板底的星形胶质细胞，用移液枪移入预先标记好的1.5 mL脱酶EP管中，向每管中加入200 μL氯仿，剧烈振荡混匀后，于冰上静置5 min，在4 ℃下以12 000 r/min离心15 min。吸取400 μL上层水相，移至另一预先标记好的1.5 mL脱酶EP管中，向每管中加入400 μL异丙醇，轻轻颠倒混匀，冰上静置10 min，在4 ℃下以12 000 r/min离心10 min。弃上清，加入DEPC水和无水乙醇配制的体积分数为0.75乙醇溶液1 mL，在4 ℃下以12 000 r/min离心10 min。弃上清，自然干燥沉淀，每孔加入10 μL DEPC水溶解RNA，置56 ℃干燥箱中10 min，于冰上静置。测定RNA浓度与光密度(OD)值，OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.8~2.0之间，表示样品无污染。根据逆转录试剂盒说明进行逆转录，得到cDNA。再根据荧光定量PCR试剂盒说明进行qPCR。结果以2^－△△ct值表示。

1.6 统计学处理

应用Graph Pad Prism软件进行统计学处理。计量资料以x±s表示，多组样本比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，两组独立样本比较采用Student’s t检验。以P＜0.05为差异有显著性。

2 结果 2.1 TNF-α对星形胶质细胞活性的影响

不同浓度(0、5、10、20、40、80 μg/L)的TNF-α作用于星形胶质细胞24 h以后，细胞活力分别为1.025±0.121、1.019±0.084、1.073±0.180、1.021±0.060、1.051±0.115、0.719±0.112(n=6)，差异有统计学意义(F=11.69，P＜0.001)。其中5、10、20、40 μg/L TNF-α处理组细胞活力与0 μg/L TNF-α处理组相比较无明显变化(q=0.100~1.248，P＞0.05)；80 μg/L TNF-α作用于星形胶质细胞后，细胞活力下降明显，与0 μg/L TNF-α处理组比较差异有统计学意义(q=7.932，P＜0.001)。故本实验采用10 μg/L浓度的TNF-α进行细胞处理。

2.2 TNF-α对星形胶质细胞C3 mRNA表达影响

TNF-α处理组和对照组细胞内C3 mRNA表达水平分别为30.410±17.872和1.003±0.081(n=6)，TNF-α处理组较对照组明显升高，差异有统计学意义(t=3.679，P＜0.01)。

2.3 TNF-α对星形胶质细胞PTX3表达影响

TNF-α处理组和对照组细胞内PTX3 mRNA表达水平分别为0.476±0.261和1.010±0.140(n=6)，TNF-α处理组较对照组明显降低，差异有统计学意义(t=4.026，P＜0.01)。

3 讨论

脑发生损伤和疾病后，反应性星形胶质细胞增多，形成胶质瘢痕^{[6, 10]}。在对各种神经退行性疾病病人的尸检中，观察到病灶脑区存在大量A1型星形胶质细胞^[7]。既往有研究结果表明，A1型星形胶质细胞对神经元和少突胶质细胞具有杀伤作用，这种神经毒性与A1型星形胶质细胞分泌的脂蛋白有关^{[7, 11]}。A2型星形胶质细胞具有促进神经元存活与组织修复作用，常由缺血诱导，在正常生理条件下，处于静息状态的星形胶质细胞的表型更接近于A2型^[12-13]。

PD是第二常见的神经退行性疾病^[1]。研究表明，在脂多糖制备的炎症模型中，小胶质细胞首先被激活，释放多种细胞因子，其中TNF-α、白细胞介素1α和补体成分1q将星形胶质细胞激活为促炎的A1型^[7]。在1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氢吡啶制备的PD动物模型中，观察到中枢神经系统处于长期炎症状态^[14]。在PD病程中，神经炎症持续存在，神经炎症导致星形胶质细胞向A1型转变，其产生的神经毒性可导致多巴胺能神经元死亡，而黑质多巴胺能神经元缺失是PD的主要病理特征之一。因此，推测神经炎症在PD发病早期起重要作用。

体内环境中，存在多种细胞因子同时作用，其作用机制复杂，无法观察到某一细胞因子的具体作用。本实验以原代培养的星形胶质细胞作为实验对象，用10 μg/L的TNF-α处理，观察单一细胞因子对星形胶质细胞激活状态的影响。TNF-α在中枢神经系统中主要由小胶质细胞和星形胶质细胞分泌，通过核因子κB引发细胞后续反应^[15-17]。C3为A1型星形胶质细胞的标记物，其表达增加提示星形胶质细胞被激活为促炎状态，而PTX3是A2型星形胶质细胞的标记物，其表达增加提示星形胶质细胞被激活为抗炎状态。本实验结果显示，在TNF-α单独作用下，原代培养的星形胶质细胞内C3表达较对照组明显升高，而PTX3表达水平较对照组明显降低，差异具有统计学意义。提示在TNF-α作用下，星形胶质细胞被激活为A1型。本研究结果为细胞因子在调控星形胶质细胞激活状态中的作用提供了新的证据。