2021, Vol. 57
2. 四川省骨科医院膝关节运动损伤科, 四川 成都 610041
类风湿关节炎(RA)是人体关节滑膜病变出现的慢性炎症反应，导致病人出现不同程度关节破坏的疾病[1-2]。目前我国RA患病率为0.42%，病程越长病人致残率越高，其中病程超过15年者致残率可高达61.3%[3-4]。既往资料显示，成纤维样滑膜细胞(FLS)在RA病人中呈病态上升，而其凋亡下降，形成血管翳侵蚀软骨，最终导致关节功能障碍甚至丧失，严重影响病人身心健康及生活质量[5-6]。在RA中，激活FLS由多信号通路决定，而Wnt信号通路具有重要性，被认为参与了RA发生发展[6-7]。锌指环指蛋白3(ZNRF3)是一种Wnt通路调控蛋白，可经泛素化降解细胞膜表面Wnt蛋白受体卷曲蛋白，从而对Wnt信号通路活性产生抑制作用[8-9]。目前关于ZNRF3的研究主要集中于肿瘤细胞中，对RA研究较少。本研究探讨ZNRF3在RA病人滑膜组织及细胞中表达，并分析其与疾病发生的关系。现将结果报告如下。
1 资料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 对象选择2018年3月—2020年3月，选择我院收治一侧RA膝关节病变病人20例，男6例，女14例，年龄(44.32±9.65)岁。红细胞沉降率为(39.84±16.56)mm/1 h，C反应蛋白为(20.42±12.65)mg/L。根据病人病灶组织位置分为观察组(病变侧，RA侧)与对照组(正常侧，C侧)。纳入标准：①符合《2018中国类风湿关节炎诊疗指南》中相关诊断标准[10]；②临床资料完整；③正常组织侧滑膜组织及检测部位无外伤，无其他炎症性疾病或一侧关节慢性疾病。排除标准：①其他肌肉骨骼疾病者；②合并重要脏器疾病者。本研究通过我院医学伦理委员会批准，所有病人及家属均知情同意。
1.1.2 主要试剂与仪器包括免疫组化、实时定量聚合酶链反应(qPCR)、Western blot方法的主要试剂与仪器。仪器：Rigel S2流式细胞仪(上海睿钰生物科技有限公司)，微量分光光度仪(美国哈希，DR 6000型)，光学显微镜(奥林巴斯，CX43型)，PCR仪(美国罗氏，LC480型)。试剂：Anti-ZNRF3一抗(上海瑞齐生物技术有限公司)，ZNRF3二抗(微蒙上海生物科技有限公司)，CD29、CD90抗体(英国BioLegend公司)，Vimentin、CD68一抗(美国Santa Cruz公司)，Ⅱ型胶原酶(美国Sigma公司)，TRIzal试剂(赛默飞世尔科技中国有限公司)，RT Master Mix试剂盒(上海力敏实业有限公司)，GAPDH一抗(武汉赛维尔公司)。
1.2 实验方法 1.2.1 标本收集与处理采用膝关节穿刺术收集RA病人两侧滑膜。将滑膜组织置入含体积分数为0.10双抗磷酸盐缓冲液(PBS)的离心管中(存放冰盒)送检。在生物安全柜中采用体积分数0.10的PBS清洗标本，并分离标本上血管和脂肪组织。将处理后标本分3份：第1份用于多聚甲醛固定；第2份处理成小块，放入冻存管中置液氮罐内10 min，再置入-80 ℃冰箱中备用；第3份放入新培养皿中，用于提取FLS。
1.2.2 苏木精-伊红(HE)染色及评分RA滑膜常规进行HE染色后，采用光学显微镜观察RA滑膜病理变化并记录。滑膜HE染色评分标准见表 1。
| 表 1 RA滑膜染色评分标准 |
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按照文献方法[11]进行免疫组化染色。采用光镜高倍视野观察细胞改变。免疫组化染色半定量评分标准[12]如下。阳性细胞百分比评分：0分，无阳性细胞；1分，阳性细胞＜25%；2分，阳性细胞25%~50%；3分，阳性细胞51%~75%；4分，阳性细胞＞75%。阳性细胞染色强弱评分：0分，无着色；1分，淡黄色；2分，棕黄色；3分，棕褐色。
1.2.4 FLS分离与培养及细胞鉴定FLS分离及培养参考文献方法[13]进行。细胞鉴定采用PBS清洗第3代冻存FLS共2次，胰蛋白酶消化后终止消化。1 200 r/min离心5 min，去培养基、PBS清洗。加1 mL单细胞悬液，并加CD90、CD29抗体行免疫荧光染色，设阴性对照。避光孵育20 min，用PBS清洗，加缓冲重悬液，采用Rigel S2流式细胞仪进行检测。
1.2.5 qPCR检测提取细胞RNA后去培养基，PBS清洗后在培养板中滴入500 μL的RA2液混匀，吹打细胞移至内套管内。以12 000 r/min离心1 min，去外套管中液体，内套管内滴500 μL洗脱液；重复操作1次。弃外套管，将内套管移入新EP管内，在膜中央加入洗脱液30 μL，室温下静置后以12 000 r/min离心1 min，获取细胞总RNA。取100 mg组织剪碎研磨，加入1 mL的TRIzal震荡30 s，室温放置至组织裂解。以8 500 r/min离心5 min取上清液，加氯仿200 μL，震荡30 s，室温放置；再离心15 min取上清液，加等量异丙醇，室温静置10 min，再离心10 min，弃上清液，加500 μL体积分数0.75的乙醇，离心5 min；重复此操作。将沉淀存放室温晾干，加10~20 μL的DEPC液溶解RNA后，提取组织RNA。应用微量分光光度仪分别检测细胞和组织RNA浓度。使用RT Master Mix试剂盒，反转录cDNA保存于-20 ℃冰箱中备用。qPCR反应采用两步法进行：①预变，195 ℃条件下持续30 s；②PCR，40、90 ℃条件下进行5 s反应或60 ℃条件下进行30 s反应。qPCR反应体系按照试剂盒说明配制，所用引物及其序列见表 2。
| 表 2 qPCR扩增引物及其序列 |
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细胞、组织蛋白提取后备用。取电泳缓冲液粉，参照说明书溶解于1 L纯水内制成电泳缓冲液。200 A电泳90 min转膜后，取出膜用50 g/L脱脂牛奶室温闭封2 h。加入一抗(1∶2 000 GAPDH抗体，1∶1 000 ZNRF3抗体)4 ℃冰箱摇床上摇动孵育10 h。次日洗膜3次，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶2 000)，室温孵育2 h，再洗膜3次。取ECL试剂A、B底物液1∶1混匀，将冲洗后的膜置入避光反应后进行显影。使用Adobe Photoshop测量各条带灰度值，采用相对灰度值表示蛋白表达量。
1.3 统计学分析应用SPSS 20.0统计软件对数据进行分析。计量资料数据用x±s表示，组间均数比较采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 两侧滑膜组织HE染色评分比较观察组炎性细胞浸润、纤维组织增生、滑膜细胞增生和新生血管形成等评分均高于对照组，差异均有统计学意义(t=54.243~98.522，P < 0.05)。见表 3和图 1。
| 表 3 病人两侧HE染色评分比较(n=20，分，x±s) |
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| a、b分别为RA患病侧和对照侧滑膜。HE染色，200倍。 图 1 RA病人两侧滑膜组织HE染色 |
本研究观察到FLS细胞核呈卵圆形，位于细胞中部，细胞形态呈梭形、星形和纺锤状，边界清晰，周围见聚集性分泌物，还混杂卵圆形巨噬样滑膜细胞(MLS)。细胞传至第3代，MLS分裂、增殖作用丧失，其后FLS、RA-FLS、C-FLS细胞形态相似。从原代FLS细胞图可见观察组(图 2a、b)生长速度较对照组(图 2c、d)增快。
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| a、b为RA病人患病侧FLS细胞，c、d为病人对照侧原代FLS细胞。免疫组化染色，400倍。 图 2 FLS细胞形态观察 |
本研究的细胞检测抗体为CD90、CD29，用于第3代RA-FLS、C-FLS细胞鉴定，若两者阳性率超过90%，则表示提取细胞为纯化FLS。本文检测结果表明，CD90、CD29两者阳性率为93.19%，提示提取细胞为纯化FLS。见图 3。
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| 图 3 FLS流式细胞检测 |
ZNRF3在观察组的免疫组化评分、mRNA和蛋白表达均明显高于对照组，差异均有统计学意义(t=8.963~105.292，P < 0.05)。见表 4和图 4。
| 表 4 ZNRF3在病人两侧滑膜组织表达比较(n=20，x±s) |
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| 图 4 Western blot检测ZNRF3蛋白在病人两侧滑膜组织表达 |
免疫荧光法检测结果显示，ZNRF3(荧光绿)在RA-FLS和C-FLS的质膜、细胞质均有表达，但RA-FLS的荧光明显强于C-FLS。见图 5。qPCR和Western blot检测结果表明，ZNRF3在RA-FLS的mRNA和蛋白表达量均明显高于C-FLS，差异均有统计学意义(t=43.330、62.721，P < 0.05)。见表 5和图 6。
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| a：RA-FLS；b：C-FLS。DAPI：4, 6-二脒基-2-苯基吲哚染色；Merge方法：重叠。免疫荧光染色，400倍。 图 5 滑膜FLS的免疫荧光检测 |
| 表 5 ZNRF3在病人两侧滑膜FLS细胞中的表达(n=20，x±s) |
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| 图 6 Western blot检测ZNRF3蛋白在RA-FLS和C-FLS表达 |
ZNRF3是一种调控蛋白，其细胞外结构与R脊柱蛋白相互作用，与富含亮氨酸的G蛋白偶联受体生成复合物，致使ZNRF3自动膜清除、泛素化，使胞膜表面卷曲受体蛋白稳定，维持Wnt信号活性通路；细胞表面ZNRF3结合巢乱蛋白某区，识别Wnt巢乱蛋白，诱导该蛋白泛素化降解，从而抑制Wnt信号通路[14-16]。有学者认为，ZNRF3对Wnt/β-catenin、Wnt/PCP信号通路呈负性调控性[17]。目前关于ZNRF的研究以肿瘤为主。已有学者指出，在肿瘤疾病中R-spondin-ZNRF3板块常发生突变[18]。有研究表明，ZNRF3对Wnt/β-catenin信号通路的调控属负性，其在肿瘤组织中表达不尽相同[19]。有学者对乳头状甲状腺癌组织与正常甲状腺组织的研究结果显示，ZNRF3在乳头状甲状腺癌组织内呈下调，且与其分化等级呈负相关[20-21]。而ZNRF3在原发性结直肠癌表达上调[22]。ZNRF3在骨关节的研究有待明确，但考虑RA病变与Wnt信号通路存在联系，推测ZNRF3可能与RA病变的发生发展有关。
本研究对膝关节RA病人的RA侧与C侧滑膜组织、细胞采用免疫组化、qRCR和Westen blot法研究显示，病人RA侧滑膜组织中ZNRF3表达高于C侧。相关研究已表明，RA侧Wnt信号通路与其组织发病有关；在RA侧组织、FLS中，β-catenin表达上调，表示Wnt通路过度激活，并抑制RA侧的成骨细胞[23-25]。由此推测，ZNRF3在RA侧滑膜组织中表达增高与Wnt信号通路在滑膜炎症中过度激活相关，ZNRF3在RA发病中可抑制被过度激活的Wnt通路，而且呈负增长表达[26-27]。进一步分析ZNRF3在RA发病中的作用，采用酶消法从滑膜组织中分离原代FLS细胞，使用Ⅱ型胶原酶将组织离散成单个细胞，并用含FBS培养基培养数天，使细胞贴壁达80%~90%[28-30]。本文光镜下观察显示，经HE染色的RA侧滑膜组织明显增生，细胞[LL]层数增加，并见大量炎性细胞浸润滑膜间质中，且伴大量新生血管生成，部分组织中见淋巴滤泡形成、间质纤维化。本文应用流式细胞检测术、免疫荧光检测对第3代细胞进行鉴定，并观察ZNRF3在FLS中的表达，结果显示，RA-FLS和C-FLS中ZNRF3均定位于细胞质和质膜，RA-FLS中ZNRF3表达明显增高，而C-FLS中无明显表达，qRCR与Westen blot检测结果也相同。上述结果均提示，激活Wnt信号通路后可诱导ZNRF3生成并在细胞核外分泌，从而调控Wnt信号通路活性。
总而言之，RA病人病变侧滑膜组织、FLS中的ZNRF3表达量升高，推测与Wnt信号通路过度激活诱导ZNRF3生成增加有关，而ZNRF3高表达可负反馈调节Wnt通路活性。
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