2021, Vol. 57
心肌纤维化是心血管疾病终末期共同的生理病理过程[1]。心肌成纤维细胞(CFs)异常增殖和胶原蛋白合成增多是心肌纤维化的重要表现，研究影响CFs增殖和胶原蛋白合成的分子机制，寻找有效的干预靶点对心血管疾病的治疗具有重要意义。还原型烟酰胺腺嘌呤双核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶非吞噬细胞氧化酶4(NOX4)是NADPH NOX家族成员，在成纤维细胞、内皮细胞和平滑肌细胞等中广泛表达，与肺、肾、肝和心脏等多种组织纤维化过程密切相关[2-3]。本研究通过观察转染NOX4小干扰RNA(siRNA)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的CFs增殖和胶原蛋白的影响，揭示NOX4在心肌纤维化过程中的作用机制。
1 材料与方法 1.1 实验材料出生2 d雄性清洁级SD乳鼠(河南省实验动物中心)。AngⅡ(美国Sigma)，胎牛血清和胰蛋白酶(美国Hyclone)，青霉素-链霉素(青链霉)双抗和DMEM培养基(美国Gibico公司)，转染试剂LipofectineTM2000(美国Invitrogen公司)，RIPA裂解液和SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(碧云天生物技术研究所)，CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所)，ECL化学发光剂和BCA蛋白浓度测定试剂盒(索莱宝生物公司)，Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ抗体(武汉博士德生物公司)，GAPDH、p38MAPK、p-p38MAPK和NOX4抗体(美国CST公司)，HRP标记山羊抗鼠IgG(天津三箭生物公司)。CO2培养箱、酶标仪和凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)。
1.2 实验方法 1.2.1 CFs分离与培养无菌条件下取SD乳鼠的心肌组织并剪碎后，加入1.25 g/L胰蛋白酶消化，收集上清液，加入含体积分数0.01青链霉双抗和体积分数0.10胎牛血清的DMEM培养基，置于37 ℃含体积分数0.05 CO2培养箱中培养。根据CFs比心肌细胞贴壁速度快的特点采用差速贴壁法贴壁培养2 h。除去未贴壁的细胞，获得的贴壁的细胞多数为CFs，并采用波形蛋白免疫荧光法鉴定为CFs(纯度达98%)。培养达80%融合度时，胰蛋白酶消化并按1∶2传代，收集第3~5代对数生长期细胞进行实验。
1.2.2 实验分组与转染本实验分为如下4组。①对照组(A组)：正常培养；②AngⅡ组(B组)：加10-6mol/L AngⅡ刺激48 h；③AngⅡ+siNC组(C组)：阴性对照NC-siRNA转染CFs后加10-6mol/L AngⅡ刺激48 h；④AngⅡ+siNOX4组(D组)：采用NOX4干扰序列NOX4-siRNA转染CFs后，加入10-6mol/L AngⅡ刺激48 h。每组设3个重复。将对数生长期的CFs以每孔106个接种至6孔细胞板上，置于37 ℃、含有体积分数0.05 CO2培养箱，培养至达70%融合时进行瞬时转染。其中，NOX4-siRNA和NC-siRNA由上海吉玛公司合成。NOX4-siRNA和NC-siRNA的RNA序列见表 1。参照转染试剂LipofectineTM2000说明书，根据实验分组将NC-siRNA和NOX4-siRNA转染至CFs中。转染5 h后更换新鲜培养液，继续培养48 h。
| 表 1 NOX4-siRNA和NC-siRNA的RNA序列 |
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采用免疫印迹法检测。收集AngⅡ刺激48 h的AngⅡ组、AngⅡ+siNC组、AngⅡ+siNOX4组和正常培养的对照组CFs，加入RIPA裂解液抽提各组细胞总蛋白后，参照BCA蛋白检测试剂盒说明书检测总蛋白的浓度。将热变性处理后的蛋白样品以每孔70 μg上样至SDS-PAGE凝胶中进行电泳分离，待分离结束后转膜。使用50 g/L脱脂奶粉封闭处理2 h后，NOX4抗体(1∶500)、GAPDH抗体(1∶1 000)4 ℃孵育过夜。次日，再以HRP标记山羊抗鼠IgG抗体(1∶2 000)室温孵育2 h。以ECL在暗室内显影后，将GAPDH作为内参照，采用凝胶成像系统扫描分析。实验重复3次。
1.2.4 细胞增殖活力检测采用CCK-8法检测。将AngⅡ处理结束后的CFs和正常培养的对照组CFs以每孔104个接种至96孔细胞板，在37 ℃、含体积分数0.05 CO2培养箱中常规培养48 h后，参照CCK-8试剂盒说明书检测各组细胞在450 nm波长处的光密度值。光密度值越大代表细胞增殖越活跃。实验重复3次。
1.2.5 Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、p-p38MAPK和p38MAPK蛋白表达的检测采用免疫印迹法检测。详细步骤可参照1.2.3。其中，在脱脂奶粉封闭后，分别采用Collagen Ⅰ抗体(1∶1 000)、Collagen Ⅲ抗体(1∶1 000)、p-p38MAPK抗体(1∶800)和p38MAPK抗体(1∶800)孵育。
1.3 统计学方法采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料数据以x±s形式表示，多组间比较使用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 转染NOX4-siRNA对CFs中NOX4蛋白表达的影响免疫印迹法检测的结果表明，对照组、AngⅡ组、AngⅡ+siNC组和AngⅡ+siNOX4组细胞中NOX4蛋白的表达水平分别为0.35±0.03、0.57±0.04、0.62±0.05和0.12±0.02，各组间NOX4蛋白的表达水平之间存在明显差异(F=349.556，P＜0.001)。见图 1。两两比较结果显示，与对照组相比，AngⅡ组细胞中NOX4蛋白表达水平明显升高(q=17.963，P < 0.05)；与AngⅡ组比较，AngⅡ+siNC组NOX4蛋白表达无明显改变(P>0.05), 但AngⅡ+siNOX4组NOX4蛋白表达水平明显降低(q=36.742，P < 0.05)。
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| A：对照组，B：AngⅡ组，C：AngⅡ+siNC组，D：AngⅡ+siNOX4组。 图 1 免疫印迹法检测NOX4蛋白的表达 |
CCK-8实验检测结果表明，对照组、AngⅡ组、AngⅡ+siNC组和AngⅡ+siNOX4组细胞增殖活力存在明显差异(F=140.134，P＜0.001)。两两比较结果显示，与对照组相比，AngⅡ刺激明显促进了CFs增殖活力(q=25.587，P < 0.05)；与AngⅡ组相比，NOX4-siRNA转染后CFs增殖活力明显降低(q=15.839，P < 0.05)，而转染NC-siNRA对CFs增殖活力无明显影响(P>0.05)。见图 2。
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| A：对照组，B：AngⅡ组，C：AngⅡ+siNC组，D：AngⅡ+siNOX4组。 图 2 转染NOX4-siRNA对CFs增殖的影响 |
免疫印迹法检测各组细胞中胶原蛋白CollagenⅠ和Collagen Ⅲ的表达结果表明，与对照组相比，AngⅡ刺激可引起CollagenⅠ和Collagen Ⅲ蛋白的表达水平升高(F=142.742、404.800，P < 0.001)。与AngⅡ组相比，转染NC-siNRA后CFs中CollagenⅠ和Collagen Ⅲ蛋白的表达无明显变化(P>0.05)，但转染NOX4-siRNA可使CFs中CollagenⅠ和Collagen Ⅲ蛋白的表达水平明显降低(q=17.242、27.727，P < 0.05)。见图 3和表 2。
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| A：对照组，B：AngⅡ组，C：AngⅡ+siNC组，D：AngⅡ+siNOX4组。 图 3 免疫印迹法检测CollagenⅠ和Collagen Ⅲ蛋白的表达 |
| 表 2 各组细胞中CollagenⅠ和Collagen Ⅲ蛋白表达的比较(n=3, x±s) |
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免疫印迹法检测各组细胞中p38MAPK信号通路相关蛋白p-p38MAPK和p38MAPK的表达结果显示，各组细胞中p38MAPK蛋白的表达水平无明显差异，但AngⅡ刺激后CFs中p-p38MAPK蛋白的表达水平较对照组明显升高(F=182.909，P＜0.001)；转染NOX4-siRNA组p-p38MAPK蛋白的表达水平明显降低(q=18.434，P < 0.05)，而转染NC-siRNA组p-p38MAPK蛋白的表达无明显变化(P>0.05)。见图 4和表 3。
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| A：对照组，B：AngⅡ组，C：AngⅡ+siNC组，D：AngⅡ+siNOX4组。 图 4 免疫印迹法检测p38MAPK信号通路相关蛋白的表达 |
| 表 3 各组细胞中p38MAPK信号通路相关蛋白表达的比较(n=3, x±s) |
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AngⅡ是经典的肾素-血管紧张素系统的重要活性成分，可刺激CFs增生和胶原蛋白的分泌等，在心肌的纤维化过程中发挥着重要作用，常被用来作为体外研究心肌纤维化的诱导因子[4-5]。本研究参照文献的方法[6]选用浓度为10-6mol/L AngⅡ刺激体外培养的CFs构建心肌纤维化细胞模型。结果显示，AngⅡ刺激后CFs增殖活力和胶原蛋白CollagenⅠ、Collagen Ⅲ表达水平均明显升高。这表明本研究中10-6mol/L AngⅡ可诱导CFs增殖和胶原蛋白合成，心肌纤维化细胞模型构建成功。
NOX4是一种与肝组织发生纤维化密切相关的NADPH氧化酶，可以通过ROS信号通路在细胞的增殖、分化和凋亡等过程中发挥着重要作用；抑制NOX4信号通路可以减弱结核性胸膜纤维化[7-8]。NOX4在非小细胞肺癌细胞增殖过程中发挥着重要的促进作用，siRNA抑制NOX4表达可通过PI3K/Akt信号传导抑制人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖[9]。此外，NOX4抑制剂可以逆转TGF-β1诱导的肺癌细胞胶原蛋白CollagenⅠ的表达；靶向干扰NOX4可抑制TGF-β1诱导CFs胶原合成[10-11]。本研究结果显示，AngⅡ可诱导CFs中NOX4蛋白表达上调。这提示NOX4在AngⅡ诱导的CFs纤维化过程中发挥着重要作用。转染NOX4-siRNA后AngⅡ诱导CFs增殖和胶原蛋白CollagenⅠ、Collagen Ⅲ的表达明显受到抑制。这提示，NOX4在AngⅡ诱导的CFs增殖和胶原合成过程中发挥着重要的促进作用。
p38MAPK信号通路是MAPK通路的重要分支，可通过磷酸化作用影响相关基因的表达，在细胞增殖、分化和发育等过程中发挥重要作用[12]。研究显示，在AngⅡ诱导的CFs增殖和胶原合成过程中p38MAPK信号通路发挥着重要的促进作用[13-14]。已有研究指出，沉默NOX4表达可抑制胰腺癌细胞中p38MAPK信号通路活化[15]。为了探讨NOX4调控CFs增殖和胶原合成的分子机制，本研究进一步检测结果表明，转染NOX4-siRNA后AngⅡ诱导p38MAPK磷酸化水平明显降低，p38MAPK信号通路的活化明显受到抑制。结果表明，在AngⅡ诱导的CFs中NOX4可调控p38MAPK信号通路。这提示NOX4介导的CFs增殖和胶原合成可能与p38MAPK信号通路的活化有关。
综上所述，NOX4-siRNA转染可抑制AngⅡ诱导的CFs增殖和胶原合成，其作用机制可能与抑制p38MAPK信号通路活化有关。该研究结果进一步阐述了心肌成纤维化发生发展的分子机制，也为以NOX4为靶点预防和改善心肌纤维化提供了新的参考依据。然而，本研究未涉及体内实验探究NOX4对心肌成纤维化的影响尚显不足，后续研究将通过动物模型对此进行补充和探究。
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