2021, Vol. 57
EB病毒(EBV)是一种普遍存在的γ疱疹病毒，世界上绝大多数人都曾感染EBV并获得适应性免疫。1964年，EBV首先在伯基特淋巴瘤中被发现[1]，随后发现其与多种人类肿瘤相关，包括霍奇金淋巴瘤、未分化的鼻咽癌以及10%左右的胃癌[2]。EBV在肿瘤细胞中表达多种潜伏基因，其中EBV编码的核抗原1(EBNA1)是唯一一个在所有EBV相关肿瘤细胞中都表达的潜伏基因。EBNA1可以与多种细胞蛋白相互作用，进而调节相关基因的表达，并且对维持EBV的潜伏感染状态起着重要作用。2014年，癌症基因组图谱(TCGA)将胃癌分为了4种分子亚型：EB病毒相关胃癌(EBVaGC)、微卫星不稳定型(MSI)、染色体不稳定型(CIN)和基因组稳定型(GS)等[3]。EBVaGC的单独分类显示其具有独特的致癌机制，并提供了将EBV用作靶向治疗胃癌的新生物标志物的机会。
E2F转录因子于1986年被首次发现，可与腺病毒E2启动子相互作用[4]。目前，已发现8个E2F转录因子家族成员(E2F1~8)，其中大多数与控制细胞周期有关，同时对细胞分化、凋亡和DNA损伤等也发挥重要作用。E2F转录因子1(E2F1)是第一个被鉴定的E2F家族成员，视网膜母细胞瘤蛋白(pRB)可与E2F1相结合，进而抑制其活性[5]。多项研究显示，E2F1在多种肿瘤组织和细胞中高表达，如肺癌、乳癌、前列腺癌等[6-8]。E2F1的表达与肿瘤的发生、发展、转移及预后密切相关。然而，在胃癌中EBV对E2F1的调控及其作用机制，以及E2F1在胃癌中发挥的作用目前尚不明确。本文构建EBNA1稳定表达的细胞模型，检测EBVaGC细胞、EBV阴性胃癌细胞(EBVnGC)及EBNA1稳定表达细胞中E2F1的表达，探讨E2F1在EBVaGC中的作用。
1 材料与方法 1.1 细胞培养本研究采用了EBVaGC细胞系GT38、GT39和SNU719以及EBVnGC细胞系SGC7901、AGS和BGC823。所有的细胞系均加入含有体积分数0.10胎牛血清以及10 g/L青霉素-链霉素混合液的DMEM培养基，置于37 ℃、含有体积分数0.05 CO2的加湿培养箱中培养。
1.2 实验材料DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司；青霉素-链霉素混合液购自北京索莱宝科技有限公司；Lipofectamine 2000试剂购自德国Invitrogen公司；RIPA裂解液、SDS-loading buffer购自北京康为世纪科技有限公司；TRIzol购自美国Invitrogen公司；FastStart Essential DNA Green Master购自德国Roche公司；Anti-EBNA1抗体购自美国Santa公司；Anti-E2F1抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；Anti-β-actin抗体、HRP标记的兔IgG和鼠IgG抗体均购自Cell Signaling Technology公司。PCR扩增仪(美国Bio-Rad公司)；Light Cycler 96荧光定量PCR仪(SN10700型，瑞士Roche公司)；SDS-PAGE垂直板型电泳仪、湿式蛋白转膜仪(美国Bio-Rad公司)；Quantum-ST5型(凝胶成像系统，法国Vilber Lourmat公司)。
1.3 构建稳定表达EBNA1的细胞模型选取EBVnGC细胞系BGC823和SGC7901，采用Lipofectamine 2000试剂分别转染EBNA1重组质粒及其对照质粒(NC)，转染24 h后于荧光显微镜下观察转染效率。待细胞汇合度至90%左右时，采用1 g/L的嘌呤霉素(Puromycin)筛选稳定表达EBNA1的细胞，直至荧光细胞含量90%以上。收集细胞，应用Western blotting方法检测EBNA1蛋白表达水平。EBNA1稳定表达细胞模型分别命名为BGC823- EBNA1及其对照BGC823-NC、SGC7901- EBNA1及其对照SGC7901-NC。
1.4 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测EBNA1和E2F1 mRNA表达采用TRIzol法提取细胞总RNA，使用First Strand cDNA合成试剂盒，将1 μg总RNA反转录为cDNA。使用FastStart Essential DNA Green Master对cDNA进行qRF-PCR。PCR反应体系20 μL，其内含有：Faststart Essential DNA Green Master Mix 10.0 μL，Forward Primer 0.5 μL，Reverse Primer 0.5 μL，RNase free water 8.0 μL，cDNA 1.0 μL。引物及其序列见表 1。所有反应均在LightCycler®96系统进行。采用2－△△Ct法分别计算EBNA1和E2F1基因相对表达量。△△Ct=△Ct实验组－△Ct对照组，2-△△Ct表示实验组目的基因相对于对照组表达差异的倍数。
| 表 1 qRT-PCR引物及其序列 |
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用含有体积分数0.10的苯甲磺酰氟(PMSF)和体积分数0.10的广谱磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液提取细胞总蛋白。将蛋白与5×的SDS-PAGE Loading Buffer混合后沸水煮5 min。然后以每孔25 μg的上样量进行SDS-PAGE凝胶电泳后转至0.45 μm的PVDF膜上。用50 g/L的脱脂牛奶室温封闭2 h后，应用TBST洗3次，一抗孵育4 ℃过夜。将孵育盒取出，一抗平衡室温30 min后，应用TBST洗3次, 室温二抗孵育2 h，以ECL化学发光法检测。用Image J软件进行蛋白灰度值分析，结果以目的蛋白灰度值/内参照蛋白灰度值表示。
1.6 统计学分析应用GraphPad Prism 8软件进行统计分析。计量资料结果以x±s表示，数据间比较采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各种细胞EBNA1和E2F1表达比较qRT-PCR和Western blotting检测显示，所有EBVaGC细胞均表达EBNA1，而EBVnGC细胞不表达；E2F1 mRNA在EBVaGC细胞的表达水平明显高于EBVnGC细胞，差异有显著性(t=13.60, P < 0.01)；而E2F1蛋白在EBVaGC和EBVnGC细胞的表达水平差异无统计学意义(t=1.757, P>0.05)。见图 1、表 2。
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| 图 1 细胞系中EBNA1和E2F1蛋白表达的检测 |
| 表 2 细胞系中EBNA1和E2F1 mRNA和蛋白表达比较(n=3, x±s) |
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Western blotting检测结果显示，EBNA1蛋白在BGC823-EBNA1和SGC7901-EBNA1细胞中稳定表达，而对照组细胞则不表达，证明EBNA1稳定表达的细胞模型已经成功建立。见图 2、表 3。
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| 图 2 EBNA1稳定表达细胞中EBNA1蛋白的表达检测 |
| 表 3 细胞模型EBNA1蛋白表达水平(n=3, x±s) |
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qRT-PCR结果显示，与对照组相比，BGC823-EBNA1组和SGC7901-EBNA1组E2F1的mRNA表达均上调，差异有显著性(t=9.939、14.080, P < 0.01)。Western blotting结果显示，与对照组相比，BGC823-EBNA1组和SGC7901-EBNA1组E2F1蛋白表达明显上调(t=6.222、4.681, P < 0.05)。见图 3、表 4。
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| 图 3 EBNA1稳定表达细胞中E2F1蛋白的表达检测 |
| 表 4 EBNA1稳定表达细胞中E2F1 mRNA和蛋白表达水平(n=3, x±s) |
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EBV是第一种被确定的人类肿瘤相关的病毒，在不同的肿瘤中具有不同的潜伏感染状态并表达不同的潜伏期基因。普遍认为EBVaGC中EBV介于Ⅰ型和Ⅱ型潜伏之间[9]，其中确定表达的病毒潜伏基因包括EBNA1和EBERs，也有部分病例可能表达LMP1或LMP2A[10-11]。EBNA1是第一个被报道的EBV潜伏期蛋白，并在所有类型的潜伏细胞中都表达，对EBV基因组的稳定存在起着重要的作用[12]，并通过与病毒附加体中特定DNA序列的相互作用激活其他EBV潜伏基因的表达。EBNA1也可以与多种细胞蛋白相互作用进而调节细胞存活和肿瘤形成，提示EBNA1对EBV相关肿瘤发生发展具有重要作用。EBVaGC约占胃癌病例的10%，是所有EBV相关肿瘤中病人数量最多的疾病[13]。EBVaGC具有独特的分子特征，例如较高的DNA超甲基化发生率、程序性死亡配体1(PD-L1)的过表达、PIK3CA和ARID1A突变显著增加和免疫浸润增加等[14]。多项研究表明，EBV感染的胃癌细胞中EBNA1表达为宿主细胞的存活、生长能力和转化潜能提供了便利，包括逃避免疫监视、降低对DNA损伤的反应或通过抑制野生型P53蛋白表达降低凋亡应激刺激敏感性等[15]。但是，EBNA1在EBVaGC中发挥的作用及其机制还需进一步研究。
E2F转录因子是多种细胞事件的重要参与者，包括细胞周期、DNA合成、DNA修复和核转录等。E2F1是E2F家族中研究最多的成员，其通过调节编码和非编码转录物的表达在肿瘤发生发展中起着关键作用[16-17]。有趣的是，E2F1可以根据细胞环境不同作为癌基因或者抑癌基因来调节肿瘤的发生[18-19]。E2F1的激活是致癌病毒促进细胞增殖的常见策略，并且其在EBV中已经得到证实。1991年，腺病毒E1A基因的产物被证明与视网膜母细胞瘤相关蛋白(Rb)相互作用[20]。此后研究也表明，Rb可与E2F转录因子家族成员结合[21]。在鉴定了所有不同形式的E2Fs后[22]，E2F1被认为是主要的Rb结合细胞蛋白[23]。E2F1蛋白的功能受视网膜母细胞瘤蛋白Rb的调节。当Rb为非高磷酸化形式时，它通过其口袋结构域与E2F1结合，并抑制E2F1的序列特异性DNA结合[24-25]。在伯基特淋巴瘤中，在核糖体活性失调的情况下，EBNA1可通过激活E2F1来恢复核糖体的活性，而不依赖于pRb[25]。EBNA3C也可以在非Rb依赖性途径中，通过募集E2F6到E2F1的启动子来下调E2F1的表达，最终导致细胞增殖[26]。另外有研究结果证明，EBNA3C可促进S18-2与pRb的结合，提高游离E2F1水平[27]。有研究显示，胃癌病人E2F1表达显著增加，E2F1可促进细胞增殖及细胞周期进展，且其高表达与胃癌病理分期差、肿瘤变大及预后更差呈正相关[28]。基于以上研究，本文在EBVaGC细胞中进行了系列实验探讨EBNA1和E2F1在肿瘤发生发展中的作用。结果显示，EBVaGC细胞中E2F1的mRNA表达较EBVnGC细胞增高，但蛋白表达水平差异无显著性；与对照组相比，过表达EBNA1后E2F1的mRNA和蛋白表达均明显上调。表明胃癌细胞中外源性EBNA1表达可促进E2F1的转录及翻译，并可能通过影响E2F1表达诱导肿瘤形成。EBVaGC细胞和EBVnGC细胞中E2F1蛋白表达差异无显著性，这可能是多种因素共同作用的结果，EBNA1对其表达的调控只是其中一个方面，具体的调控机制还有待进一步研究。
综上所述，EBNA1可能通过上调E2F1的表达，从而促进EBVaGC的发生发展。阐明EBV介导的肿瘤生成的具体机制，有助于E2F1高表达胃癌病人的临床治疗，扩大治疗效益。因此，EBNA1对E2F1表达调控的具体机制以及E2F1在胃癌中的生物学功能有进一步研究的意义。对EBV编码EBNA1调控E2F1表达的研究可能为EBV相关肿瘤的靶向治疗提供实验依据。
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