2020, Vol. 56
目前关于子宫内膜异位症发病机制尚未完全阐明[1-2]。既往研究已表明，体腔化生、血管转移等均可能引发子宫内膜异位症，而人异位子宫内膜细胞(HEEC)恶性增殖及凋亡能力降低是子宫内膜异位症的主要病理机制[3-4]。因此，深入探究HEEC增殖及凋亡的分子机制有助于提高子宫内膜异位症治疗效果。研究已表明，微小RNA-141(microRNA-141，miR-141)在子宫内膜异位症病人中表达下调，但关于其具体作用机制尚未明确[5-6]。miR-141是微小RNA-141-3p(microRNA-141-3p，miR-141-3p)的前体，关于miR-141-3p对HEEC生物行为的影响及其机制研究相对较少。已有研究表明，子宫内膜异位症病人中高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的表达水平升高，其可能通过调节新生血管生成而参与子宫内膜异位症发生过程[7]。Target Scan网站预测显示，HMGB1可能是miR-141-3p的靶基因，但miR-141-3p是否可通过靶向调控HMGB1而影响HEEC的增殖及凋亡尚未明确。为此，本研究探讨miR-141-3p表达对HEEC增殖及凋亡的影响，分析其与HMGB1的靶向调控关系及其可能作用机制。现将结果报告如下。
1 资料与方法 1.1 一般资料2016年2月—2018年10月，选取本院收治的45例子宫内膜异位症病人为研究对象，年龄35~60岁，平均(45.52±5.62)岁。临床分期[8]：Ⅱ期10例，Ⅲ期20例，Ⅳ期15例。所有病人均经手术病理证实为子宫内膜异位症，术前3个月内未服用性激素类药物，于术中切取异位内膜组织。同时，选取同期因妇科良性病变进行子宫切除术的43例病人为对照组，年龄为42~60岁，平均(56.72±7.13)岁。所有病人均经手术病理证实，术中切取正常子宫内膜组织。排除合并其他生殖系统肿瘤者。两组病人年龄、月经周期等相比较差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。本研究经本院伦理委员会批准，病人均知情并签署同意书。
1.2 实验材料DMEM培养基购自美国Hyclone公司；胰蛋白酶和胎牛血清均购自美国Gibco公司；Ⅰ型胶原酶购自上海百赛生物技术股份有限公司；miR-141-3p mimics、miR-141-3p抑制剂(anti-miR-141-3p)及其各自阴性对照试剂均购自广州锐博生物科技有限公司；Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；Trizol试剂购自北京全式金生物技术有限公司；反转录试剂盒与实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测试剂盒均购自美国Thermo Fisher公司；MTT细胞增殖检测试剂盒购自上海生物工程股份有限公司；Annexin V-FITC/PI检测试剂盒购自武汉艾美捷科技有限公司；双荧光素酶活性检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；RIPA裂解液购自美国Sigma公司；兔抗人Cyclin D1、Bcl-2、P21、Bax抗体购自美国Abcam公司；HRP标记的IgG二抗购自武汉博士德生物工程有限公司；兔抗人HMGB1抗体购自武汉菲恩生物科技有限公司。
1.3 实验方法 1.3.1 体外原代培养HEEC应用差速梯度离心与细胞贴壁时间差等方法分离异位内膜腺上皮细胞及间质细胞。剪碎膜组织，Ⅰ型胶原酶(2 g/L)消化60 min，用100目滤网过滤，将含有PBS的DMEM培养液加入滤液内，4 ℃条件下，以700 r/min离心7 min，弃上清，接种至培养皿(间质细胞)，加入含有体积分数0.10胎牛血清的培养液，放入37 ℃、体积分数0.05 CO2培养箱内培养[9]。
1.3.2 实验分组待HEEC传代至第3代时，收集生长状态良好的HEEC，随机分为miR-NC组(细胞中转染miR-NC)、miR-141-3p组(转染miR-141-3p mimics的细胞)。严格按照Lipofectamine2000转染试剂说明书的步骤进行操作，转染6 h后更换含有体积分数0.10胎牛血清的DMEM完全培养基，继续培养48 h，收集对数生长期的细胞完成功能验证实验。
1.3.3 qRT-PCR检测miR-141-3p表达水平采用Trizol法分别提取正常子宫内膜组织、异位子宫内膜组织、HEEC的总RNA，依次分别加入200 μL氯仿与500 μL异丙醇，4 ℃下、12 000 r/min离心15 min，弃上清，RNA沉于管底。以体积分数0.75乙醇洗涤RNA沉淀，晾干后加入适量无RNA酶水，充分溶解RNA，置于－80 ℃超低温冰箱保存。应用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，qRT-PCR法检测miR-141-3p相对表达量。反应条件：95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共循环40次。miR-141-3p以U6为内参，采用2－ΔΔCt法计算miR-141-3p的表达水平。
1.3.4 MTT检测细胞增殖收集转染后各组的HEEC，胰蛋白酶消化，制备细胞悬浮液，以每孔3× 105个细胞的密度接种于96孔板。分别于培养24、48、72 h时每孔入MTT溶液20 μL，室温孵育4 h，弃上清，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)溶液150 μL，低速振荡10 min。利用酶标仪检测各孔在490 nm波长处的吸光度(A)。每组实验均重复3次。
1.3.5 流式细胞术检测细胞凋亡收集各组对数生长期HEEC，PBS洗涤，胰蛋白酶消化，4 ℃下、10 000 r/min离心5 min。PBS洗涤细胞，分别加入200 μL结合缓冲液，依次加入5 μL的Annexin V-FITC与5 μL的PI，室温避孵育20 min。置于流式细胞仪检测细胞凋亡率。每组实验均重复3次。
1.3.6 荧光素酶报告基因检测靶基因预测网站预测miR-141-3p的靶基因，预测显示miR-141-3p与HMGB1的3′UTR存在结合位点，将含有miR-141-3p结合位点及其突变位点的HMGB1-3′UTR片段插入PGL3荧光素酶报告基因载体，构建野生型(WT-HMGB1)与突变型(MUT-HMGB1)的荧光素酶报告载体。实验分为4组：WT-HMGB1+miR-NC共转染组、WT-HMGB1+miR-141-3p mimics共转染组、MUT-HMGB1+miR-NC共转染组、MUT-HMGB1+miR-141-3p mimics共转染组。转染24 h后收集细胞，采用双荧光素酶活性检测试剂盒检测各组相对荧光素酶活性。每组实验均重复3次。
1.3.7 蛋白免疫印迹(Western blot)检测HMGB1、Cyclin D1、Bcl-2、P21、Bax蛋白表达分别取各组HEEC，加入细胞裂解液裂解细胞，4 ℃条件下、12 000 r/min离心15 min。收集上清，BCA法测定蛋白浓度。蛋白煮沸变性，取30 μg蛋白上样进行100 g/L的SDS-PAGE凝胶电泳，将分离的蛋白凝胶转移至PVDF膜。50 g/L脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗(稀释比1:1 000)，4 ℃孵育24 h，TBST清洗；加入二抗(稀释比1:2 000)，室温孵育30 min，TBST洗膜。应用ECL试剂盒进行化学发光反应，置于凝胶成像系统并应用Quantity One软件定量分析蛋白条带灰度值。每组实验均重复3次。
1.4 统计学处理应用SPSS 19.0软件进行统计学处理，计量资料数据以x±s表示，两组均数间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 正常和异位子宫内膜组织miR-141-3p表达本文qRT-PCR检测结果表明，正常与异位子宫内膜组织中miR-141-3p表达水平分别为0.87±0.08和0.17±0.02，异位子宫内膜组织中miR-141-3p表达水平较正常子宫内膜显著降低，差异有显著意义(t=56.880，P＜0.001)。
2.2 miR-141-3p过表达对HEEC增殖与凋亡及相关蛋白影响HEEC中转染miR-141-3p mimics后，与miR-NC组(对照组)相比，miR-141-3p组(实验组)细胞活力显著降低(t=10.972~13.403，P＜0.001)，细胞凋亡率显著升高(t=18.233，P＜0.001)，Cyclin D与Bcl-2蛋白的水平降低(t=24.931、25.456，P＜0.001)，P21与Bax蛋白的水平则升高，差异均有统计学意义(t=19.312、20.175，P＜0.001)。见图 1与表 1、2。
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| A：miR-141-3p过表达对HEEC凋亡的影响；B：miR-141-3p过表达对HEEC增殖与凋亡相关蛋白表达的影响。对照组：miR-NC；实验组：miR-141-3p。 图 1 miR-141-3p过表达对HEEC增殖与凋亡及相关蛋白影响 |
| 表 1 miR-141-3p过表达对HEEC增殖及相关蛋白影响(n=9，x±s) |
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| 表 2 miR-141-3p过表达对HEEC凋亡及相关蛋白影响(n=9, x±s) |
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Target Scan预测显示，HMGB1的3′UTR含有miR-141-3p的互补序列。见图 2A。双荧光素酶报告实验结果显示，WT-HMGB1+miR-NC共转染组、WT-HMGB1+miR-141-3p mimics共转染组、MUT-HMGB1+miR-NC共转染组和MUT-HMGB1+miR-141-3p mimics共转染组HMGB1的相对荧光素酶活性分别为1.05±0.10、0.27±0.03、1.07±0.10和1.02±0.09，HEEC细胞中转染miR-141-3p mimics可显著降低含有miR-141-3p结合位点荧光报告载体的相对荧光素酶活性(n=9，t=22.413，P＜0.001)；后两组比较差异无统计学意义(t=1.115，P＞0.05)。Western blot的检测结果显示，miR-NC组、miR-141-3p组、anti-miR-NC组和anti-miR-141-3p组HMGB1蛋白表达分别为0.63±0.06、0.21±0.02、0.64±0.06和0.99±0.10，各组比较差异有显著性(n=9，F=208.278，P＜0.001)。miR-141-3p过表达后，细胞中HMGB1蛋白的水平为0.21±0.02，与miR-NC组的0.63±0.06相比较显著降低(t=19.922，P＜0.05)；抑制miR-141-3p表达后，细胞中HMGB1蛋白水平为0.99± 0.10，与anti-miR-NC组的0.64±0.06相比较显著升高(t=9.004，P＜0.05)。见图 2B。表明HMGB1是miR-141-3p的靶基因，miR-141-3p可负性调控HMGB1的表达。
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| A：HMGB1的3′UTR含有miR-141-3p的互补序列。B：Western blot检测HMGB1表达，a为miR-NC组、b为miR-141-3p组、c为anti-miR-NC组、d为anti-miR-141-3p组。 图 2 miR-141-3p靶向对HMGB1蛋白表达的影响 |
子宫内膜异位症主要指子宫腔被覆内膜外存在子宫内膜组织生长及浸润。研究表明，miRNA可通过调控下游靶基因表达而参与子宫内膜异位症发生过程[10-12]。但仍有部分miRNA在子宫内膜异位症中的机制尚未完全阐明，因此本研究探寻新型miR-141-3p在子宫内膜异位症发生过程中的可能作用机制。miR-141-3p在肿瘤细胞中呈低表达，miR-141-3p过表达后可显著抑制细胞增殖及其侵袭能力，诱导细胞凋亡[13-20]。但是，miR-141-3p在子宫内膜异位症中的表达及其作用机制尚不明确。本研究结果显示，miR-141-3p在异位子宫内膜组织中呈低表达，说明miR-141-3p表达降低可能参与子宫内膜异位症发生过程。本文进一步研究显示，miR-141-3p过表达后，HEEC的增殖能力显著降低，细胞凋亡率显著升高，Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达下调，P21、Bax蛋白表达上调。已有报道指出，Cyclin D1可正向调控细胞周期进程，促进细胞增殖；P21可以通过抑制Cyclin D1与CDK4结合而阻滞细胞周期进程，抑制细胞增殖[21-26]。Bcl-2、Bax蛋白是HEEC凋亡过程中的重要作用因子，Bcl-2蛋白表达升高可抑制HEEC凋亡，而Bax蛋白表达升高可促进HEEC凋亡[27]。说明miR-141-3p过表达可通过干扰细胞增殖及凋亡相关蛋白而调节HEEC的增殖及凋亡行为。即miR-141-3p过表达可抑制HEEC的增殖，促进其凋亡。
HMGB1在子宫内膜异位症病人血清中的表达水平升高，并可作为子宫内膜异位症诊断的重要指标[28]。HMGB1属于DNA结合蛋白。研究表明，HMGB1可促进炎症反应及血管生成，还可通过调节多种信号转导通路而参与多种疾病发生及发展过程[29。相关研究报道指出，HMGB1还可通过促进Treg细胞分泌及增强其介导的免疫抑制作用而参与子宫内膜异位症发生过程[30]。本研究结果表明，miR-141-3p可靶向调控HMGB1表达。提示miR-141-3p过表达可能通过靶向调控HMGB1而抑制HEEC增殖，诱导其凋亡。
综上所述，子宫内膜异位症病人中miR-141-3p的表达明显降低，miR-141-3p过表达可能通过调控HMGB1的表达而抑制HEEC的增殖及促进其凋亡。本研究结果为揭示子宫内膜异位症的发病机制奠定理论基础，为子宫内膜异位症治疗提供了新的思路。但关于miR-141-3p在子宫内膜异位症发生及发展过程中，具体通过调控哪种信号通路而发挥作用尚需进一步探究。
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