2020, Vol. 56
心血管系统疾病的致死率在全部疾病中位居首位, 心血管疾病严重危害着人类的生命健康[1]。动脉粥样硬化是一种常见的发生于心血管系统的疾病, 也是心血管疾病发生的征兆[2]。高血压、高脂血症、糖尿病、肥胖等均能够引发动脉粥样硬化[3]。冠心病是动脉粥样硬化导致的较为典型的心血管疾病[4]。动脉粥样硬化的发病机制是目前研究的热点。载脂蛋白C3(APOC3)广泛存在于人体内, 在循环血浆中稳定表达[5]。APOC3与冠心病、高血压、糖尿病等疾病的发生密切相关[6]。血管内皮细胞存在于血管的最内层, 在动脉粥样硬化的发生过程中具有重要的作用, 而APOC3是血管内皮细胞功能的障碍因子[7]。目前, 关于APOC3对血管内皮细胞肿瘤坏死因子-α(TNF-α)与连接黏附分子-1(JAM-1)表达的影响还不明确。本研究分别收集了冠状动脉有狭窄和无狭窄心脏病病人外周血清, 检测APOC3的表达水平, 并以血管内皮细胞为研究对象, 探讨APOC3对TNF-α与JAM-1表达影响, 以期为进一步研究动脉粥样硬化的发病机制奠定基础。现将结果报告如下。
1 资料与方法 1.1 一般资料2017年12月—2018年10月, 选取在我院行手术或冠状动脉造影检测的心脏病病人80例, 男性42例, 女性38例, 平均年龄48岁。其中有冠状动脉狭窄者56例, 无狭窄者24例。均符合文献的诊断标准[8]。冠状动脉狭窄病人与无狭窄者的年龄、性别等均匹配。本研究病人及家属均知情同意, 并经过医院伦理委员会批准。
1.2 实验材料人脐静脉血管内皮细胞购自美国ATCC公司。APOC3、TNF-α试剂购自Prepro Tech公司; TNF-α、JAM-1、GAPDH单克隆抗体购自美国CTS公司; 人APOC3 ELISA检测试剂盒购自上海超研生物科技有限公司; CO2培养箱购自美国Thermo公司; 倒置显微镜购自日本尼康公司。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒、cDNA合成试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司; CFX 96Touch荧光定量PCR仪、GelDoc 2000凝胶成像系统均购自美国Bio-Rad公司。
1.3 实验方法 1.3.1 血清APOC3水平检测采集80例心脏病病人空腹12 h后的外周静脉血3 mL。血液凝固后分离出血清。采用ELISA法检测血清中APOC3含量。按照试剂盒说明书操作。
1.3.2 细胞培养取出保存于液氮罐中的人血管内皮细胞, 置37 ℃培养箱中融化后, 加入含有体积分数0.10胎牛血清(FBS)的DMEM细胞培养液, 混匀后以1 000 r/min离心10 min, 弃上清液, 用5 mL细胞培养液悬浮细胞, 接种到细胞培养瓶中, 置37 ℃、体积分数0.05 CO2培养箱中培养。48 h后, 观察细胞约为90%融合时, 弃掉细胞悬浮液, 用PBS洗涤细胞2次。加入2.5 g/L胰蛋白酶消化细胞, 离心后用细胞培养液悬浮细胞, 接种到细胞培养瓶中继续培养。
1.3.3 qRT-PCR检测人血管内皮细胞中TNF-α、JAM-1 mRNA表达取培养至对数生长期的人血管内皮细胞, 加入胰蛋白酶消化细胞后, 再加入细胞培养液悬浮细胞, 接种到12孔细胞培养板中, 调整细胞密度使每孔中加入的细胞数为4×105个。置37 ℃、体积分数0.05 CO2培养箱中培养24 h后, 弃上清液。在细胞中分别加入终浓度为0、15、30、60、120 mg/L的APOC3作用16 h后, 用PBS洗涤细胞2次。加入Trizol细胞裂解液, 提取细胞RNA, 按照荧光定量PCR试剂盒说明书分别检测TNF-α、JAM-1 mRNA水平。所用引物及其序列见表 1。实验重复3次, 每次3个复孔。
| 表 1 qRT-PCR引物及其序列 |
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人血管内皮细胞分别经0、15、30、60、120 mg/L的APOC3作用16 h后, 收集细胞, 加入细胞裂解液, 放置于冰上裂解30 min。4 ℃下12 000 r/min离心15 min, 取蛋白上清至新EP管中, 用BCA蛋白浓度检测试剂盒检测提取的蛋白浓度。蛋白样品与Loading buffer煮沸变性后, 加入到SDS-PAGE凝胶孔中, 每孔中加入变性蛋白样品50 μL, 以初始电压为80 V电泳30 min后, 调整电压为120 V至电泳结束。取出蛋白凝胶在4 ℃下转印至PVDF膜上。经50 g/L脱脂奶粉封闭后, 依次与一抗(1:500)、二抗(1:1 000)反应后, 转移至暗室中滴加显色液, 曝光后以GAPDH为内参, 分析蛋白表达率。实验重复3次, 每次3个复孔。
1.3.5 TNF-α对人血管内皮细胞JAM-1 mRNA和蛋白表达影响取培养至对数生长期的人血管内皮细胞, 弃细胞培养液, 用胰蛋白酶消化后, 接种到12孔细胞培养板中, 置37 ℃、体积分数0.05 CO2培养箱中培养24 h后, 将细胞培养液换成含有终浓度为0、1.0 mg/L的TNF-α细胞培养液, 培养16 h后收集细胞。采用qRT-PCR、Western blot检测细胞中JAM-1 mRNA和蛋白表达水平。步骤同1.3.3和1.3.4。实验重复3次, 每次3个复孔。
1.4 统计学处理采用SPSS 22.0统计学软件进行分析, 计量资料数据以x±s表示, 两组均数比较用t检验, 多组比较采用单因素设计方差分析。以P < 0.05为差异有显著性。
2 结果 2.1 病人血清中APOC3含量检测结果表明, 56例冠状动脉有狭窄病人血清APOC3为(9.36±0.95)g/L, 明显高于24例无狭窄病人的(7.42±0.74)g/L, 差异有显著性(t=2.790, P < 0.01)。
2.2 APOC3对血管内皮细胞JAM-1 mRNA和蛋白表达影响采用15、30、60、120 mg/L的APOC3作用后, 血管内皮细胞中JAM-1 mRNA和蛋白水平均高于0 mg/L者; 血管内皮细胞中JAM-1 mRNA和蛋白水平随着15、30、60 mg/L的APOC3作用浓度的增加而增加(F=69.633、178.421, t=9.137~17.473, P < 0.01)。而120 mg/L的APOC3作用后, 细胞中JAM-1 mRNA和蛋白水平较60 mg/L者有所下降。见表 2。
| 表 2 APOC3对血管内皮细胞JAM-1和TNF-α mRNA和蛋白表达影响(n=3, x±s) |
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采用15、30、60、120 mg/L的APOC3作用16 h后, 血管内皮细胞中 TNF-α mRNA和蛋白均明显高于0 mg/L者(F=28.746、50.426, P < 0.01)。TNF-α mRNA和蛋白水平没有随着APOC3作用浓度的升高而增加。见表 2。
2.4 TNF-α对血管内皮细胞中JAM-1 mRNA和蛋白表达影响采用1.0 μg/L的TNF-α作用后, 血管内皮细胞中JAM-1 mRNA和蛋白水平均明显高于0 μg/L者, 差异有显著性(t=8.167、15.589, P < 0.01)。见表 3。
| 表 3 TNF-α对血管内皮细胞中JAM-1 mRNA和蛋白表达影响(n=3, x±s) |
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动脉粥样硬化是一种常见的动脉硬化血管疾病。动脉粥样硬化形成与复合糖类和脂质的聚集、血栓的形成、纤维组织增生的出现、动脉中层的钙化等有关。当病变逐渐累积到阻塞动脉腔时, 由该动脉供应的组织器官出现缺血甚至坏死[9]。动脉粥样硬化血管弹性减弱, 管壁上出现类似于米粒样的脂类[10-11]。另外, 动脉粥样硬化会导致动脉腔变窄, 进而引发高血压心脏病的发生。
载脂蛋白是指血浆脂蛋白中的蛋白成分, 可以分为A、B、C、D、E等5类[11]。载脂蛋白是脂类物质的运输载体, 其中部分载脂蛋白还具有脂蛋白代谢酶激活、受体的识别等作用[12]。载脂蛋白C具有水溶性, 能够调控肝脂酶和脂蛋白脂酶的活性[13]。APOC3基因全长为3.1 kb, 位于第11号染色体上[14]。临床研究结果表明, APOC3能够引起冠心病的发生, 与高血压、高脂血症、肥胖等均有密切关系[15]。过表达APOC3小鼠的高三酰甘油血症明显加重, 经过饲喂高脂饲料后, 小鼠出现脂肪肝变性和明显的胰岛素抵抗[16]。已有研究结果显示, 冠状动脉狭窄病人血清总APOC3浓度明显升高[17]。本文研究结果也显示, APOC3在冠状动脉狭窄病人血清中的表达明显增高。
免疫炎症是目前研究较多的动脉粥样硬化的发病机制。脂质的积累和炎症的共同长期作用导致动脉粥样硬化的发生[18]。APOC3、TNF-α、JAM-1等均与动脉粥样硬化的发生有关[19]。有研究结果表明, JAM-1在动脉粥样硬化斑块组织中的表达增高[20]。TNF-α是一种具有多重作用的细胞因子, 具有调节血管内皮功能的作用, 与动脉粥样硬化的形成密切相关[21]。本研究用不同浓度的APOC3作用血管内皮细胞, 观察TNF-α、JAM-1 mRNA和蛋白表达的变化。本文结果表明, TNF-α、JAM-1 mRNA和蛋白表达均上调。其中JAM-1 mRNA和蛋白表达水平在一定浓度范围内呈现浓度依赖, 而TNF-α mRNA和蛋白表达水平并没有出现浓度依赖。采用TNF-α作用后, 血管内皮细胞中JAM-1 mRNA和蛋白表达升高, 提示APOC3可能通过诱导TNF-α表达进而促进血管内皮细胞中JAM-1的表达。
综上所述, APOC3在动脉粥样硬化病人血清中表达上调。APOC3可能通过诱导TNF-α表达进而促进血管内皮细胞中JAM-1的表达, APOC3可能是炎症、细胞黏附的连接分子, 有望成为预防和治疗动脉粥样硬化的靶点。本研究为进一步探讨动脉粥样硬化的发病机制奠定了基础, 为治疗动脉粥样硬化提供了新思路。由于动脉粥样硬化发病机制极其复杂, 对APOC3在动脉粥样硬化中的具体作用机制, 有待于进一步研究。
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