2020, Vol. 56
2. 安阳市人民医院胸外科
食管癌发病是由多种因素共同作用的结果，随着基因高通量测序技术的发展，长链非编码RNA(lncRNA)被认为在多种癌症发展中扮演重要角色[1-2]。已有研究结果表明，lncRNA参与人体细胞增殖、分化、转移、凋亡等生物学活动，其在多种恶性肿瘤发展中也发挥作用[3-6]。尿路上皮癌相关基因1(UCA1)是癌症调节耐药基因，参与多种肿瘤的恶性发展[7-12]，如胃癌、肺癌、直肠癌等。UCA1是一种来源于人类内源性逆转录病毒(HERV-H)家族的lncRNA分子，其基因定位于人类第19号染色体(19p13.12)，全长为1.4 kb。lncRNA UCA1最初在膀胱癌被发现，并能够促进肿瘤细胞增殖和转移[13]。目前，lncRNA UCA1在食管癌中表达及其作用研究报道较少。本文对lncRNA UCA1在食管鳞癌中表达及其对癌细胞黏附和迁移的调控进行分析，探讨lncRNA UCA1用于食管鳞癌病人早期诊断及术后监测的临床价值。现将结果报告如下。
1 资料与方法 1.1 一般资料2016年5月—2018年5月，收集在本院接受手术治疗的52例食管鳞癌病人作为研究对象，男性28例，女性24例，年龄48~72岁，平均(62.8±7.6)岁。纳入标准：所有病人均经术后组织病理检查证实为食管鳞癌，手术前均未给予化疗及放疗处理。排除标准：肝肾功能异常、免疫缺陷、其他恶性肿瘤，以及并发高血压、糖尿病等全身系统疾病者。该组病人均自愿接受手术，对本次研究均知情同意。本研究经过我院医学伦理委员会批准。
1.2 仪器和试剂 1.2.1 主要仪器全自动组织包埋机(日本樱花集团)；光学显微镜(日本OLYMPUS公司)；实时荧光定量PCR(qRCR)仪(CFX96型，美国Bio-Rad公司)；Eppendorf Research移液器(德国Eppendorf公司)；台式低温超速离心机(德国Eppendorf公司)；－80 ℃冰箱(美国Thermo公司)；CO2培养箱(美国Thermo公司)等。
1.2.2 主要试剂苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(索莱宝(中国)公司)，Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司)，All-in-OneTM miRNA qRT-PCR Detection kit(美国Gene Copoeia公司)，PCR扩增引物、DEPC水(生工生物工程(上海)技术有限公司)，氯仿、异丙醇、无水乙醇(中国国药集团)，胎牛血清(德国PAN公司)，2.5 g/L的胰蛋白酶、青霉素/链霉素注射液(新赛美生物科技有限公司)，人食管鳞癌细胞系Eca109、KYSE170、KYSE150、KYSE9706、KYSE30、TE1和TE13(上海弘顺生物科技有限公司)，质粒si-uca1、si-nc和pc-dna-uca1(上海吉凯基因化学技术有限公司合成)。
1.3 实验方法 1.3.1 标本获取及处理取病人原发灶处部分癌组织及距离原发灶边缘3~5 cm正常组织。标本切除后立即分为两部分：一部分在新鲜状态下用RNA保存液保存以提取RNA；另一部分用40 g/L甲醛溶液固定，做成蜡块保存，用于HE染色。
1.3.2 lncRNA UCA1表达的qPCR检测Trizol法提取总RNA，采用qPCR两步法进行检测。设计lncRNA UCA1引物，然后使用反转录试剂盒进行反转录得到cDNA，配制qPCR反应体系，设置反应程序(95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s)进行qPCR扩增。通过软件得到Ct值，单位为HU。
1.3.3 食管癌细胞迁移和侵袭实验采用划痕试验和Transwell侵袭实验分别检测UCA1基因对食管癌细胞迁移能力和侵袭能力的影响。构建表达载体并提取重组质粒，对重组质粒si-UCA1/pc-DNA UCA1进行鉴定，随后进行大量的提取和纯化，测定其浓度和纯度，保存备用。将重组质粒进行转染，转染后提取RNA进行荧光定量验证转染效率。以肿瘤细胞膜着色判断为阳性，根据阳性细胞数及阳性细胞染色强度判断基因表达结果，其中≥3+为过表达，＜3+为低表达。按操作说明进行划痕试验，在倒置显微镜下观察划痕后0、12、24 h的划痕间距，计算细胞迁移率。根据操作说明进行Transwell侵袭实验，计数透过人工基底膜的细胞数。
1.4 统计学方法采用SPSS 17.0统计软件进行分析，计量资料数据以x±s表示，计数资料以百分数表示。两组间比较采用t检验和χ2检验，两组以上比较采用F检验。以P < 0.05为差异有显著性。
2 结果 2.1 癌组织和癌细胞UCA1表达食管鳞癌组织和癌旁组织的HE染色见图 1。qPCR结果表明，原发灶癌组织中UCA1的Ct值为(1.52±0.56) HU，癌旁组织为(0.95±0.36) HU，两者比较差异有显著意义(t=6.174，P < 0.01)。UCA1在人食管癌细胞系中的相对表达量分别为：Eca109(0.61±0.08)、KYSE170(0.52±0.11)、KYSE150(0.31±0.05)、KYSE9706(0.29±0.19)、KYSE30(0.28±0.18)、TE1(0.21±0.11)和TE13(0.22±0.12)，均明显高于正常食管上皮细胞NE1(0.07±0.03)，差异具有统计学意义(F=107.26，P＜0.01)。并且Eca109、KYSE170细胞中UCA1表达相对较高，而在TE1和TE13细胞中UCA1的表达较其他细胞系低。因此，选择代表性的食管癌细胞系Eca109、KYSE170、TE1和TE13进行后续相关的研究。
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| A：食管鳞状细胞癌组织；B：癌旁组织未见癌细胞侵袭。 图 1 食管癌组织和癌旁组织的HE染色观察 |
在12和24 h细胞的划痕间距百分比结果表明，与Eca109及KYSE170细胞比较，过表达UCA1基因明显抑制食管癌细胞系TE1和TE13迁移能力，差异有统计学意义(F=187.38~243.88，P < 0.01)；与TE1和TE13细胞比较，低表达UCA1基因能够明显促进食管癌细胞系Eca109和KYSE170的迁移能力，差异也有统计学意义(F=133.00~1 252.32，P < 0.01)。见表 1。
| 表 1 UCA1基因表达对食管癌细胞迁移能力的影响(n=52，χ/%，x±s) |
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UCA1过表达的TE1和TE13细胞能够透过人工基底膜的数量明显高于Eca109和KYSE170，差异有统计学意义(F=1 388.68，P < 0.01)。提示UCA1基因的过度表达显著促进了TE1和TE13食管癌细胞系的侵袭性。UCA1低表达的Eca109和KYSE170细胞透过人工基底膜的数量明显低于TE1和TE13，差异有统计学意义(F=426.20，P < 0.01)。提示UCA1基因的低表达显著抑制了食管癌细胞系Eca109和KYSE170的侵袭性。见表 2。
| 表 2 UCA1基因表达对食管癌细胞侵袭能力的影响(n=52, x±s) |
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lncRNAs能够在表观遗传学、转录调控和转录后调控等不同水平上调控基因表达。国外的研究结果显示，lncRNAs的异常表达在各种恶性肿瘤的发生过程中起着重要作用[14-17]。肿瘤的发生是原癌基因激活、抑癌基因失活和细胞的永生化等过程所致，正常细胞有完善调控系统使有抑癌作用和致癌作用lncRNAs处于动态平衡，而在肿瘤细胞中这种平衡被打破。研究显示，UCA1在多种肿瘤的发生中发挥作用，如胃癌、胰腺癌和宫颈癌等[18-21]。
本文对UCA1在食管鳞癌中的表达水平及其对肿瘤细胞的迁移、黏附调控作用进行探讨。qPCR结果表明，原发灶癌组织中UCA1的Ct值明显高于癌旁非肿瘤组织，说明肿瘤组织中的UCA1表达水平明显升高，这与已有报道结果相符[22-24]。说明UCA1与食管癌的发生有一定关系，提示UCA1有可能作为食管癌的肿瘤标志物。
肿瘤细胞发生侵袭和转移涉及细胞外基质的降解和上皮细胞-间充质转化(EMT)，细胞间黏附破坏对上皮可塑性的维持非常重要，该过程由钙黏蛋白介导，这已被证实是癌症的最初事件[25]。在肿瘤的发展过程中，细胞黏附破坏是一个重要的侵袭和转移事件。本文对UCA1表达在食管鳞癌细胞侵袭和迁移中的影响进行观察，研究结果显示，低表达UCA1可抑制Eca109和KYSE170细胞迁移能力，过表达UCA1促进了TE1和TE13细胞迁移能力；低表达UCA1抑制了Eca109和KYSE170细胞的侵袭能力，过表达UCA1促进了TE1和TE13细胞侵袭能力。这表明过表达的UCA1可以促进食管鳞癌细胞的迁移、侵袭能力，反之，干扰UCA1则起到相反的作用。国外通过流式细胞术分析显示，低表达UCA1基因可以上调EMT相关转录因子E-cadherin的表达，下调N-cadherin、Snail和Vimentin的表达，抑制食管癌细胞的迁移和侵袭能力；过表达UCA1基因可以下调EMT相关转录因子E-cadherin的表达，上调N-cadherin、Snail和Vimentin的表达，促进食管癌细胞的迁移和侵袭能力[26]。
综上所述，lncRNA UCA1在食管鳞癌呈高表达水平，促进食管癌细胞侵袭和迁移能力，抑制了食管癌细胞凋亡。本研究同时也证实，血清lncRNA UCA1可作为食管鳞癌病人诊断的新型潜在的循环肿瘤标志物，值得临床推广应用。
| [1] |
YAO G L, PAN C F, XU H, et al. Long noncoding RNA RP11-766N7.4 functions as a tumor suppressor by regulating epithelial-mesenchymal transition in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Biomed Pharmacother, 2017, 88(5): 778-785. |
| [2] |
闫素真, 杜鲁涛, 王丽丽, 等. 血清lncRNA UCA1在食管鳞癌的表达及临床意义[J]. 山东大学学报(医学版), 2018, 56(6): 41-46. |
| [3] |
吴璇, 邝钢, 任利兵, 等. 长链非编码RNA ZNF667-AS1在食管鳞状细胞癌组织中的表达及其DNA甲基化状态的研究[J]. 肿瘤防治研究, 2018, 45(12): 976-980. DOI:10.3971/j.issn.1000-8578.2018.18.0586 |
| [4] |
曹巍, 闫明, 吴伟, 等. 食管鳞状细胞癌特异相关长链非编码RNA转录物1在食管鳞状细胞癌中的表达及预后意义[J]. 中华消化杂志, 2018, 38(6): 365-370. DOI:10.3760/cma.j.issn.0254-1432.2018.06.002 |
| [5] |
LU C, YANG L, CHEN H, et al. Upregulated long non-coding RNA BC032469 enhances carcinogenesis and metastasis of esophageal squamous cell carcinoma through regulating hTERT expression[J]. Tumor Biology, 2016, 37(12): 16065-16075. DOI:10.1007/s13277-016-5428-9 |
| [6] |
方海云, 高丰厚. 循环长链非编码RNA在消化道肿瘤中的研究进展[J]. 现代肿瘤医学, 2017, 25(13): 2160-2163. DOI:10.3969/j.issn.1672-4992.2017.13.038 |
| [7] |
林姜鑫, 王伟伟, 王莉, 等. 长链非编码RNA(linc02471)对食管鳞状细胞癌细胞增殖和侵袭的影响[J]. 中国卫生检验杂志, 2018, 28(5): 516-519. |
| [8] |
江楠, 田海华, 潘金昌, 等. 循环长链非编码RNA作为生物标志物在肿瘤分子诊断中的应用[J]. 生物工程学报, 2017, 33(6): 910-922. |
| [9] |
GUO W, DONG Z, SHI Y, et al. Aberrant methylation-mediated downregulation of long noncoding RNA LOC100130476 correlates with malignant progression of esophageal squamous cell carcinoma[J]. Digestive and Liver Disease, 2016, 48(8): 961-969. DOI:10.1016/j.dld.2016.05.010 |
| [10] |
WANG Chaojie, ZHU Chunchao, XU Jia, et al. The lncRNA UCA1 promotes proliferation, migration, immune escape and inhibits apoptosis in gastric cancer by sponging anti-tumor miRNAs[J]. BioMed Central, 2019, 18(1): 257-261. |
| [11] |
LI Yucheng, XIN Jiang, SUN Wencai. LncRNA urothelial carcinoma-associated 1 (UCA1) regulates rat bone marrow mesenchymal stem cell differentiation and promotes repair of bone defects[J]. American Scientific Publishers, 2019, 9(10): 1125-1138. |
| [12] |
HUANG Zhi, ZHAO Xuya, WU Xiaowen, et al. LncRNA UCA1 facilitated cell growth and invasion through the miR-206/CLOCK axis in glioma[J]. BioMed Central, 2019, 19(3): 783-796. |
| [13] |
张继威, 蔡璐莹, 夏舜尧, 等. 长链非编码RNA在肾癌中的研究进展[J]. 临床与病理杂志, 2019, 39(11): 2532-2537. DOI:10.3978/j.issn.2095-6959.2019.11.031 |
| [14] |
韩建秋, 郝丽惠, 邢雅玲, 等.长链非编码RNA UCA1通过激活PI3K/Akt途径降低人宫颈癌SiHa细胞放射敏感性[J/OL].现代妇产科进展, 2020(4): 263-266[2020-04-30]. https://doi.org/10.13283/j.cnki.xdfckjz.2020.04.033.
|
| [15] |
YU Rucui, ZHANG Yan, LU Zhihui, et al. Long-chain non-coding RNA UCA1 inhibits renal tubular epithelial cell apoptosis by targeting microRNA-206 in diabetic nephropathy[J]. Pubmed, 2019, 8(5): 1835-1847. |
| [16] |
张丹, 李万军, 李曾. lncRNA UCA1通过抑制miRNA-203a对乳腺癌细胞化疗耐药作用的影响[J]. 癌症进展, 2019, 17(14): 1656-1658+1663. |
| [17] |
杨毅, 陈林. 多发性骨髓瘤的lncRNA研究进展[J]. 中国临床研究, 2019, 32(07): 996-998. |
| [18] |
施光清, 马李杰, 张庭秀, 等. 长链非编码RNA: UCA1在恶性肿瘤中的表达和功能研究进展[J]. 西南军医, 2019, 21(4): 332-336. |
| [19] |
田建海, 李晓娟, 郭怀远, 等. 膀胱癌组织中UCA1、miR-141的表达及临床意义[J]. 中国医药导报, 2019, 16(20): 121-124. |
| [20] |
宋小青, 王革玲. 血清长链非编码RNA H19、ATB和UCA1在宫颈癌的差异表达及相关性分析[J]. 国际检验医学杂志, 2019, 40(12): 1480-1485. DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2019.12.017 |
| [21] |
刘春丽, 康维亭. 长链非编码RNA对泌尿系统肿瘤耐药性的影响研究进展[J]. 济宁医学院学报, 2019, 42(3): 196-200. DOI:10.3969/j.issn.1000-9760.2019.03.010 |
| [22] |
蔡静静, 周永春. 长链非编码RNA尿路上皮癌胚抗原1在实体瘤中的作用和机制[J]. 中国医药, 2019, 14(4): 637-640. |
| [23] |
向万平, 谭望, 姚林, 等. 长链非编码RNA在胃癌耐药中研究进展[J]. 四川医学, 2019, 40(3): 306-309. |
| [24] |
徐晋珩, 刘丽云, 鄢丽敏, 等. 长链非编码RNA UCA1对微卫星不稳定的人类结肠癌细胞侵袭和迁移能力的影响[J]. 中国老年学杂志, 2018, 38(19): 4770-4774. DOI:10.3969/j.issn.1005-9202.2018.19.060 |
| [25] |
曹卫刚, 杨振林. 肿瘤微环境与上皮-间质转化在肿瘤转移中的研究进展[J]. 肿瘤基础与临床, 2019, 32(6): 547-549. DOI:10.3969/j.issn.1673-5412.2019.06.026 |
| [26] |
徐文品, 焦琨, 张伟. 长链非编码RNAs在口腔鳞癌中的研究进展[J]. 实用肿瘤学杂志, 2018, 32(3): 258-262. |