2020, Vol. 56
原发性肝癌死亡率在消化系统恶性肿瘤中位居第3位，其病理类型中以肝细胞型多见。在我国慢性病毒性肝炎是肝细胞癌(HCC)的主要危险因素，HCC发生是一个多步骤的过程[1]。基因测序技术揭示了许多遗传变化，包括复发突变基因和信号通路失调[2]，这些都与肝癌的发生和发展有关。但是肝癌仍然是一种致命的疾病，术后复发率高，关于其预测、诊断、治疗和预后监测仍有许多问题亟待解决[3]。亲环素家族(CYPs)在生物界广泛存在，其中亲环素A(CYPA)是发现最早、研究最深入的一个家族成员[4]。相关的研究结果已表明，CYPA在许多恶性肿瘤组织中高表达，并与肿瘤生长、转移和耐药等密切相关[5-6]。新环素J(CYPJ)为近期研究发现的新成员，又称PPIL3，包括PPIL3a和PPIL3b两条可变的剪切体[7]。CYPJ与CYPA序列相似度约为50%[8]，参与免疫反应、细胞增殖和凋亡等过程[9-10]。然而，关于CYPJ在HCC的生物学功能尚不清楚。本实验研究CYPJ在HCC中表达情况及其与病人临床病理特征及预后的关系，并通过沉默CYPJ基因表达抑制SK-Hep1细胞生长，为评估病人预后和开发新的靶向药物提供依据。
1 材料和方法 1.1 数据来源和分析利用UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu)在线网站，通过输入“PPIL3(CYPJ)”基因名称，分析TCGA数据库中HCC组织(371例)和癌旁正常组织(50例)中CYPJ mRNA表达情况，及其与临床病理分级的关系。利用cBioPortal(http://www.cbioprtal)在线网站，选择TCGA数据库中HCC，分析PPIL3表达情况与HCC病人预后的关系。
1.2 实验样本HCC癌组织和癌旁正常组织样本40对，均来自烟台毓璜顶医院肿瘤科2012年3月—2013年4月收治病人，入组前未接受放疗或化疗。其中37例HCC病人乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性，31例HCC病人有肝硬化。40例病人中男35例，女5例；年龄40~71岁，平均(51.83±8.85)岁。电话随访，开始时间为病人确诊时间，结束时间为病人死亡或随访截止时间(2018年4月)。SK-Hep1细胞购自ATCC细胞库。本研究获得了病人或其家属的书面知情同意，并得到了我院伦理委员会的批准。
1.3 实验材料RPMI-1640培养基、胰蛋白酶、胎牛血清(美国Gibco公司产品)；Trizol试剂、逆转录试剂盒(美国Invitrogen公司)；MTT试剂盒(碧云天生物技术研究所)。
1.4 构建慢病毒介导的CYPJ基因沉默携带短发夹状干扰RNA(shRNA)的慢病毒载体由上海吉凯基因化学技术有限公司构建，其正向序列为：gCTGGAAGAGGAGGCAACAG；其反向序列为：CTGTTGCCTCCTCTTCCAGc；接头序列为：TTCAAGAGA。含有3′dUdU的小干扰RNA(siRNA)片段si-CYPJ(5′-CUGGAAGAGGAGGC- AACA-3′)和si-control(5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′)均由上海吉凯基因化学技术有限公司合成，并用Blast进行序列对比，检测结果显示构建的si-CYPJ序列与其他CYPS的mRNA没有显著的同源性，连接病毒载体进行下一步实验。
1.5 细胞培养与转染SK-Hep1细胞用25 cm×25 cm的培养瓶培养，置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的培养箱中，培养基为含体积分数0.01胎牛血清的RPMI-1640 5 mL。取对数生长期的SK-Hep1细胞，经消化、离心，以每孔2×105个细胞密度接种于6孔板中。随机分为实验组和对照组，待细胞生长至70%融合时按照慢病毒转染试剂盒说明书进行转染。实验组转入CYPJ表达干扰的慢病毒(CYPJ-RNAi-LV组)，对照组转入空载慢病毒(NC-LV组)。转染完成后于培养箱中继续培养，为后续实验做准备。
1.6 实时荧光定量PCR(qPCR)检测组织和细胞中CYPJ mRNA表达水平取40对HCC癌组织和癌旁正常组织研磨，提取总RNA，逆转录为cDNA，加入引物进行qPCR。引物及其序列见表 1。PCR的最佳条件为：95 ℃预变性5 min，扩增40周期(95 ℃、50 s，63 ℃、1 min，72 ℃、30 s)，以25 μL体积(内含SYBR Premix Ex 12.5 μL，TapⅡ1 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，7.5 μL dH2O)进行PCR反应。实验重复3次，用2－△△Ct法计算HCC癌组织和癌旁正常组织中CYPJ mRNA相对表达量。细胞转染48 h后，收集CYPJ-RNAi-LV组和NC-LV组细胞，提取细胞总RNA，检测各组CYPJ mRNA表达水平，实验步骤同上。实验重复3次。
| 表 1 PCR引物及其序列 |
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取对数生长期的SK-Hep1细胞接种于96孔板，分为CYPJ-RNAi-LV组和NC-LV组，每组设3个复孔。将病毒上清液分别加入到各组细胞中，感染复数(MOI)设置为0、0.2、2.0、20.0和200.0，孵育96 h后，各组细胞每孔加入MTT溶液20 μL(浓度为5 g/L)，置于培养箱中培养4 h，然后每孔加入Formazan溶解液100 μL，混匀并使结晶溶解，在细胞培养箱内继续孵育4 h。用酶联免疫检测仪检测各孔570 nm波长处光密度(OD)值，绘制细胞生长曲线，以细胞增殖率(ODCYPJ-RNAi-LV组/ODNC-LV组×100%)表示细胞增殖情况。
1.8 统计学方法采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，计数资料结果以x±s形式表示，组间比较采用t检验；采用Kaplan-Meier生存曲线进行生存分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 HCC癌组织和癌旁正常组织中CYPJ mRNA表达水平比较qPCR检测结果显示，40对HCC癌组织和癌旁正常组织中CYPJ mRNA的相对表达量分别为0.894±0.422、0.668±0.303，HCC癌组织中CYPJ mRNA表达高于癌旁正常组织，差异有统计学意义(t=2.759，P < 0.05)。该结果与TCGA数据库分析结果一致。见图 1。
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| A：癌组织；B：癌旁正常组织。注：**P < 0.05。 图 1 HCC癌组织和癌旁组织中CYPJ mRNA表达比较 |
HCC癌组织中CYPJ mRNA相对表达量与病人性别、年龄、甲胎蛋白(AFP)、肿瘤大小、HBsAg、有无肝硬化和有无癌栓等无相关性(P>0.05)，而与临床病理分级有关(t=2.557，P < 0.05)。该结果与TCGA数据库分析结果一致。见表 2。
| 表 2 HCC癌组织CYPJ mRNA表达与临床病理特征相关性(x±s) |
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以CYPJ mRNA表达水平中位数0.754为截点，将HCC病人分为低表达组和高表达组，采用Kaplan-Meier生存曲线分析显示，低表达组和高表达组生存时间分别为(53.8±10.1)、(36.1±14.2)个月；中位生存时间分别为55.3、28.9个月，5年生存率分别为55.0%、22.5%。Log-rank检验显示，低表达组病人的总生存时间(OS)较高表达组病人延长，两组比较差异有显著性(χ2=9.464，P < 0.01)，与cBioPortal在线网站分析结果一致。见图 2。
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| 图 2 CYPJ mRNA表达水平对HCC病人总生存期的影响 |
CYPJ-RNAi-LV组和NC-LV组细胞的CYPJ mRNA相对表达量分别为0.414±0.047和0.846±0.542，两组相比较差异有显著意义(t=10.409，P < 0.01)。
2.5 沉默CYPJ基因表达对SK-Hep1细胞生长的影响MTT法检测结果显示，MOI为20.0、200.0时CYPJ-RNAi-LV组OD值明显低于NC-LV组，差异有统计学意义(t=3.231、8.976，P < 0.01)。沉默CYPJ基因表达可抑制SK-Hep1细胞增殖。见图 3。
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| 注：*P < 0.05，**P < 0.01。 图 3 沉默CYPJ基因表达对SK-Hep1细胞生长的影响 |
HCC多起病隐匿，多数病人就诊时已属中晚期，术后复发和肝内外转移是导致HCC预后不良的主要原因，因此需要早发现和早治疗以提高治疗效果[11]。导致HCC发生的危险因素有很多，包括肝炎病毒(HBV或HCV)感染、病毒性肝炎、乙醇性肝硬化以及非乙醇性脂肪性肝炎等[12]。据统计约有80%的HCC病人是HBV携带者，这表明HBV感染在肝癌的发生、发展中具有重要作用[13]。有研究结果显示，早期HCC病人通过有效的治疗5年生存率可显著提高[14]。常用的肿瘤标志物为AFP，但其灵敏度和特异度较低[15]。随着基因组学和蛋白质组学等技术的应用，有望获得特异性肝癌肿瘤标记物，为肝癌的早期发现提供依据[16]。
CYPs家族具有肽基脯氨酰基顺反式异构酶(PPlase)活性和分子伴侣功能，在多种疾病中发挥重要作用[17]。其中，CYPA参与病毒感染[18]、炎性疾病[19]和肿瘤形成[6]等病理过程。CYPA与环孢素A(Cs A)具有高度亲合力[17]，二者在细胞内相互作用可以形成CYPA-Cs A复合物，该复合物可以阻断丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)/p38信号通路的活化，从而抑制细胞的增殖[20]。另有研究发现，CYPA在非小细胞肺癌(NSCLC)中高表达，可以促进细胞增殖、侵袭和迁移，p38抑制剂SB 203580可以抑制细胞的迁移[21]。在治疗晚期NSCLC病人时发现，Cs A与吉非替尼组合比单独应用吉非替尼更有效[22]。ZHAO等[23]研究发现，含喹喔啉的ZX-J-19及其衍生物ZX-J-19j和ZX-J-19l可抑制PPIase活性，对肿瘤细胞生长有显著的抑制作用，且效果比Cs A好。还有研究发现，HCC病人CYPA高表达与耐药相关基因的表达及化疗耐药产生有关[24]。这些研究表明，CYPA在肿瘤发生、发展中具有重要作用，并与耐药产生有关，而亲环素抑制剂在治疗肿瘤方面具有重要的意义。由于CYPA和CYPJ序列相似度高，可能在某些功能上极为相似，CYPJ在肿瘤发生发展中的作用值得探讨。
在2005年，已有研究者通过基因芯片技术将CYPJ作为差异性基因，从脑胶质瘤组织中筛选出来[25]。另有研究通过对11项全基因组相关研究进行分析发现，CYPJ(2q33)可作为乳癌的风险基因，该研究结果有助于提高乳癌家族发病风险的预测[26]。PHILIPPE等[27]的研究结果显示，亲环素抑制剂(CRV431)可以抑制亲环素PPlase的活性，从而抑制小鼠肝脏内的HBV DNA水平。HBV感染是HCC最常见的危险因素，这一研究结果为HCC治疗带来了启示。GONG等[28]应用免疫组化实验对120例胃癌组织和癌旁组织研究发现，CYPJ在胃癌组织中高表达，且与肿瘤分化程度有关，在肿瘤生长过程中具有重要作用。本研究通过UALCAN在线网站分析显示CYPJ在HCC中高表达，与临床病理分级有关，并通过qPCR实验进一步验证了数据库分析的结果。有研究结果表明，在癌细胞中CYPJ与凋亡蛋白相互作用，影响其发挥作用，为研究凋亡蛋白在细胞中的定位机制提供了新的方向[29]。SELMANSBERGER等[30]在对核辐射后甲状腺癌研究时发现，CLIP2参与细胞凋亡、MAPK信号传导和遗传不稳定性等致癌过程，且影响CYPJ的表达水平。本文研究结果显示，通过沉默CYPJ基因的表达可以抑制SK-Hep1细胞的生长，证明了CYPJ可以促进癌细胞增殖，其具体作用机制有待下一步实验。本研究结果还显示，CYPJ基因高表达HCC病人预后差，结果与cBioPortal在线网站分析结果一致。其次，本文结果还显示，沉默CYPJ基因表达可抑制SK-Hep1细胞增殖，并选择高效率MOI为后续实验做准备；CYPJ在肿瘤生长过程中具有重要作用，并影响病人预后。目前关于CYPJ在肝癌中作用研究较少，值得进一步研究。
总之，CYPJ基因在HCC癌组织中表达升高，并影响病人预后。沉默CYPJ基因表达可以抑制细胞增殖，其作用机制可能与MAPK/p38信号通路有关，有待下一步研究证实。CYPJ可能成为评估病人预后、开发新型抗癌药物的潜在靶点。
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