星形胶质细胞是中枢神经系统中数量最多的一类神经胶质细胞，它们在维持细胞外液动力学、调节神经递质代谢、促进神经再生和修复中起重要的作用^[1]，在帕金森病(PD)的发生发展中也具有重要作用^[2]。PD是一种常见的神经变性疾病，其病理特征为黑质致密部多巴胺(DA)能神经元的选择性缺失^[3]。神经炎症则是PD神经变性的主要因素之一^[4]。在病理情况下，过度活化的星形胶质细胞释放一系列炎性递质，如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、环氧化酶2(COX-2)^[5]和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)等，可以引起神经炎症^[6]，并激活小胶质细胞继续释放炎性递质加重神经炎症，从而诱导神经元死亡^[7-8]。因此，有效抑制星形胶质细胞的活化和炎性因子的释放对于PD的治疗有重要意义。大麻素Ⅱ型受体(CB₂受体)是一种G蛋白耦联受体^[9]，大量研究表明CB₂受体在中枢神经系统疾病的发病中起重要作用^[10-11]。关于CB₂受体治疗神经炎症反应的研究已经取得了一定进展。有研究证实，WIN55、212-2(合成CB_1/2受体激动剂)和JWH133(选择性CB₂受体激动剂)^[12]通过激活小胶质细胞CB₂受体抑制脂多糖^[13]和β-淀粉样蛋白^[14]诱导的TNF-α和一氧化氮(NO)的产生；在动物实验中激活胶质细胞CB₂受体可以通过抑制炎症反应来保护DA能神经元^[15-16]。CB₂受体不仅在小胶质细胞中表达，在星形胶质细胞和神经元中也有表达^[17]，但目前缺少关于星形胶质细胞中CB₂受体的研究。目前尚不清楚JWH133能否通过选择性激活CB₂受体抑制星形胶质细胞的炎症反应。本研究应用1-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP⁺)制备原代星形胶质细胞的炎症模型，观察JWH133对MPP⁺诱导的COX-2和iNOS基因表达的影响，以及CB₂受体拮抗剂AM630的阻断效应，确定JWH133激活星形胶质细胞CB₂受体是否具有抗炎作用，从而为PD的治疗提供新靶点。

1 材料与方法 1.1 实验材料

二甲基亚砜(DMSO)、MPP⁺购自美国Sigma-Aldrich公司；DEMED/F12培养液购自美国Hyclone公司；青霉素/链霉素溶液购自索莱宝公司；CB₂受体激动剂JWH133和抑制剂AM630购自美国Tocris Bioscience公司，用DMSO溶解制成储备溶液(1 mmol/L)置于－20 ℃储存，使用时用培养液稀释至工作浓度；兔源CB₂受体抗体购自英国Abcam公司；兔源GAPDH抗体购自博奥森生物技术有限公司；HRP标记山羊抗兔IgG购自联科生物技术有限公司；TRIzol购自南京诺唯赞生物科技有限公司；PCR逆转录试剂盒和SYBR Green购自abm公司；新生SD大鼠购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。

1.2 细胞培养及分组

取新生24 h SD大鼠中脑，将其置于DEMED/F12基础培养液中，除去脑膜和血管，用1 000、200、10 μL枪头轻轻吹打使其呈浑浊离散状态，收集至大离心管中。离心，弃上清，加入含体积分数0.10胎牛血清、20 g/L青霉素/链霉素的DEMED/F12培养液，吹打混匀后将细胞接种到培养瓶中，在37 ℃、含体积分数0.05 CO₂培养箱中差速黏附处理(倒置放置)30 min，隔天更换新鲜培养液培养7 d以上，待细胞长满瓶底90%以上时，置于37 ℃摇床中以210 r/min振荡16~18 h除去其他胶质细胞，更换新鲜培养液，用胰酶消化法收集细胞，采用特定星形胶质细胞标记物(GFAP)的免疫荧光染色进行鉴定，星形胶质细胞纯度≥95%，进行下一步实验。将原代培养的星形胶质细胞分为Control组(A组)、MPP⁺组(B组)、JWH133+MPP⁺组(C组)和AM630+JWH133+MPP⁺组(D组)。Control组正常培养；MPP⁺组加入200 μmol/L的MPP⁺孵育24 h；JWH133+MPP⁺组用1 μmol/L JWH133预处理40 min，然后加入200 μmol/L MPP⁺共孵育24 h；AM630+JWH133+MPP⁺组用1 μmol/L JWH133和1 μmol/L AM630预处理40 min，然后加入200 μmol/L MPP⁺共孵育24 h。

1.3 免疫印迹法(Western Blot)检测CB₂受体蛋白的表达

Control组和MPP⁺组星形胶质细胞经处理后，吸净培养板中的培养液，每孔加入100 μL的裂解液(RIPA裂解液:PMSF=99:1)，冰上裂解30 min。刮下底部的蛋白置于相应的EP管中，在4 ℃下以12 000 r/min离心20 min，取上清80 μL，用BCA法测定蛋白浓度。每组蛋白的上样量为20 μg，电泳(电压为80 V和120 V)后将蛋白转移至PDVF膜上(转膜电流为300 mA)。用50 g/L BSA封闭液封闭1 h，然后将PDVF膜放入CB₂受体一抗溶液中，置4 ℃摇床上孵育过夜。次日用TBST清洗3次，每次10 min，将PDVF膜放入二抗中，室温孵育1 h，重复TBST清洗。使用ECL显色液处理进行显影。目的蛋白的表达以CB₂受体与GAPDH灰度值的比值表示。实验重复5次，取平均值。

1.4 实时荧光定量PCR(PT-PCR)检测COX-2和iNOS mRNA水平

本文4组星形胶质细胞经处理后，采用TRIzol法提取总RNA，将每个样品在1 000 μL TRIzol试剂中匀浆以纯化总RNA，使用反转录试剂盒对2 μg的总RNA进行反转录：加入AccuRT反应混合物(4×)和DEPC水，使总体积达到8 μL，42 ℃变性2 min；加入12 μL的反应体系(内含AccuRT反应混合物终止液2 μL、多合一RT Master Mix(5×)4 μL、DEPC水6 μL) 25 ℃作用10 min，继以42 ℃作用15 min逆转录合成cDNA。采用SYBR Green染料法定量检测COX-2和iNOS的基因表达^[18]。大鼠原代星形胶质细胞RT-PCR扩增引物及其序列见表 1。采用2^－△△CT法计算目的基因相对表达量。实验重复5次，取均值。

1.5 统计学分析

应用Graphpad Prism 5.0软件进行统计学分析，实验所得数据以x±s表示，两组间比较采用F检验，多组间的比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，然后用Turkey法进行组间两两比较，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果 2.1 MPP⁺处理对原代星形胶质细胞CB₂受体蛋白表达的影响

Control组和MPP⁺组CB₂受体蛋白相对表达量分别为0.80±0.08和1.12±0.08，两组比较差异有统计学意义(F=29.78，P＜0.01)。表明MPP⁺处理可以上调原代星形胶质细胞CB₂受体蛋白的表达，提示炎症时星形胶质细胞CB₂受体表达增多。见图 1。

2.2 JWH133对MPP⁺诱导的原代星形胶质细胞COX-2和iNOS基因表达的影响

与Control组相比，MPP⁺组COX-2和iNOS基因表达明显上调(F=22.59、11.27，q=10.13、5.57，P＜0.01)；JWH133+MPP⁺组细胞COX-2和iNOS基因表达水平较MPP⁺组均明显降低，差异均具有统计学意义(q=6.26、4.16，P＜0.05)；而JWH133的抗炎作用可被AM630阻断，AM630+ JWH133+MPP⁺组COX-2和iNOS基因表达水平较JWH133+MPP⁺组明显升高，差异有统计学意义(q=5.34、5.67，P＜0.01)。见表 2。

3 讨论

大麻素系统包括内源性大麻素、大麻素受体以及内源性大麻素的合成酶和降解酶。大麻素受体包含大麻素Ⅰ型受体(CB₁受体)和CB₂受体^[7]。大麻素受体与G蛋白耦联，通过抑制腺苷酸环化酶和电压门控钙通道(例如N型、P/Q型和L型钙电流)介导信号转导^[9]，激活有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)和向内整流钾离子通道^[19]。与CB₁受体调节相比，CB₂受体的激活已经被证明没有精神副作用^[20]。近年来关于激活CB₂受体对神经退行性疾病具有保护作用的研究日渐增多，尤其是针对它的抗炎作用，已有大量研究证据支持CB₂受体可以通过参与抑制炎症反应而起到神经保护作用^[21-22]。GÓMEZ-GÁLVEZ等^[23]发现，使用HU-308(一种CB₂受体激动剂)激活CB₂受体可以抑制脂多糖诱导的纹状体和黑质中炎性因子(例如iNOS)的表达。CHUNG等^[16]的研究表明，使用大麻素受体激动剂WIN55、212和JWH133激活CB₂受体，可以调节1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氢吡啶(MPTP)诱导的小胶质细胞活化和炎性因子的表达，从而防止PD小鼠模型中黑质纹状体DA能神经元的死亡。TAO等^[24]于2016年发现，JWH133激活CB₂受体可以通过促进小胶质细胞表型从M1转至M2，显著抑制炎性因子的释放^[25]，从而对神经炎症产生影响。JWH133是一种选择性CB₂受体激动剂，对CB₂受体的选择性是CB₁受体的200倍，对CB₂受体具有很高的亲和力^[11]。本课题组在前期工作中已显示，JWH133激活CB₂受体具有对抗MPP⁺诱导的SH-SY5Y细胞凋亡和神经毒性的作用。关于CB₂受体起到的神经保护作用，人们更关注的是CB₂受体在小胶质细胞中的抗炎作用，或者CB₁/CB₂受体在中枢神经系统中的协同工作^[26]。但是最近有研究通过免疫组织化学实验分析显示，在PD病人脑中黑质区CB₂受体与星形胶质细胞共定位，而不与其他神经胶质细胞或神经元共定位^[27]。而且与正常对照组相比较，在PD病人中枢神经系统炎症状态下，星形胶质细胞CB₂受体的表达急剧增加^[28]。星形胶质细胞在PD进程中炎症所导致的神经元功能障碍和死亡中起关键的作用^[28-29]，活化的反应性星形胶质细胞释放炎性因子(如IL-1β、TNF-α、COX-2和iNOS)以及活性氧的产生增加^[30]，会加剧炎症过程，促进PD的发生^{[7, 31]}。而抑制活化的星形胶质细胞释放炎性因子将会对PD起到一定的改善作用。

MPP⁺是MPTP的有毒代谢产物，它可以激活神经胶质细胞、神经元和肥大细胞释放神经炎性递质^[32]。本实验应用MPP⁺制备原代星形胶质细胞炎症模型。Western Blot检测结果显示，MPP⁺作用于原代星形胶质细胞可引起CB₂受体蛋白表达的升高，表明炎症时星形胶质细胞CB₂受体表达增多。为了检测CB₂受体表达增多是否具有抗炎作用，本研究使用选择性CB₂受体激动剂JWH133来激活CB₂受体，然后通过检测炎性因子COX-2和iNOS的基因表达水平，探讨JWH133对炎症反应的作用。COX-2是生成前列腺素的关键酶，iNOS可催化生成NO，它们对神经元具有毒性作用，参与并诱导神经炎症，导致神经元细胞死亡^[33]。本实验研究结果显示，使用1 μmol/L的JWH133对原代星形胶质细胞进行预处理，能够有效抑制MPP⁺诱导的COX-2和iNOS基因表达上调，表明选择性激活CB₂受体对原代星形胶质细胞具有明显的抗炎作用。进一步使用1 μmol/L的AM630进行验证，结果显示其能够阻断JWH133的抗炎作用。

综上所述，本实验初步证明JWH133激活CB₂受体能抑制MPP⁺诱导的原代星形胶质细胞的炎症反应，抑制COX-2和iNOS基因的表达，其抗炎作用可以被AM630所阻断。本文结果为通过激活CB₂受体抑制星形胶质细胞神经炎症从而治疗PD提供了新的方案^[34]，但还需要进一步研究其所涉及的机制。