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  青岛大学学报(医学版)  2020, Vol. 56 Issue (2): 169-172   DOI: 10.11712/jms.2096-5532.2020.56.070
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基金项目

国家自然科学基金面上项目(31471079)

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弭雪, 隗闯, 张萌, 等. GHS-R1a缺失对Aβ1-42模型小鼠空间学习和记忆影响[J]. 青岛大学学报(医学版), 2020, 56(2): 169-172.   DOI: 10.11712/jms.2096-5532.2020.56.070
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MI Xue, WEI Chuang, ZHANG Meng, et al. EFFECTS OF GHS-R1A DEFICIENCY ON SPATIAL LEARNING AND MEMORY IN AN Aβ1-42-INJECTED MOUSE MODEL[J]. Journal of Qingdao University(Medical Sciences), 2020, 56(2): 169-172.   DOI: 10.11712/jms.2096-5532.2020.56.070
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作者简介

弭雪(1995-)，女，硕士研究生.

通讯作者

周宇(1973-)，女，博士，教授，博士生导师。E-mail：yuzhou7310@163.com.

文章历史

收稿日期：2020-01-10
修订日期：2020-03-16
Contents              Abstract              Full text              Figures/Tables              PDF
GHS-R1a缺失对Aβ1-42模型小鼠空间学习和记忆影响
弭雪 , 隗闯 , 张萌 , 石海群 , 陈娜 , 周宇     
青岛大学基础医学院生理学与病理生理学系，山东 青岛 266071
收稿日期：2020-01-10；修订日期：2020-03-16
基金项目：国家自然科学基金面上项目(31471079)
作者简介：弭雪(1995-)，女，硕士研究生.
通讯作者：周宇(1973-)，女，博士，教授，博士生导师。E-mail：yuzhou7310@163.com.
摘要：目的 探讨GHS-R1a缺失对Aβ1-42模型小鼠空间学习和记忆的影响。方法 借助脑立体定位注射技术，5只GHS-R1a敲除的Ghsr1a－/－小鼠及6只同窝对照野生型Ghsr1a+/+小鼠背侧海马CA1区注射Aβ1-42，另外7只野生型Ghsr1a+/+小鼠背侧海马CA1区注射等量生理盐水(NS)作为空白对照。1周后对3组小鼠同时进行Morris水迷宫训练和测试，检测小鼠的空间学习和空间记忆能力。结果 Ghsr1a+/++Aβ1-42组小鼠经过6 d的训练能够迅速找到水下隐匿平台，且找到平台所用的时间与Ghsr1a+/++NS组小鼠比较差异无显著意义(P＞0.05)，说明Aβ1-42注射不影响小鼠的空间学习。水迷宫测试显示，Ghsr1a+/++NS组小鼠在平台象限探索的时间百分比明显高于其他3个象限(F=8.401，q=5.603~7.642，P＜0.01)，说明训练后该组小鼠形成了正常的空间记忆；而接受Aβ1-42注射的两组小鼠在平台象限探索的时间百分比与其他3个象限相比，差异均无显著性(P＞0.05)，提示这两组小鼠存在空间记忆障碍。接受Aβ1-42注射的两组小鼠在平台象限探索的时间百分比比较，差异也无显著性(P＞0.05)。结论 海马脑区Aβ1-42注射损害小鼠的空间记忆能力，对小鼠的空间学习能力无影响。GHS-R1a敲除不能改善Aβ1-42模型小鼠的空间记忆障碍。
关键词：受体，胃促生长素    淀粉样β肽类    CA1区，海马    空间学习    空间记忆    小鼠    
EFFECTS OF GHS-R1A DEFICIENCY ON SPATIAL LEARNING AND MEMORY IN AN Aβ1-42-INJECTED MOUSE MODEL
MI Xue , WEI Chuang , ZHANG Meng , SHI Haiqun , CHEN Na , ZHOU Yu     
Department of Physiology and Pathophysiology, School of Basic Medicine, Qingdao University, Qingdao 266071, China
ABSTRACT: Objective To investigate the effects of GHS-R1a deficiency on spatial learning and memory in an Aβ1-42-injected mouse model. Methods Five GHS-R1a knock-out mice (Ghsr1a-/-) and six wild-type littermates (Ghsr1a+/+) received a stereotactic injection of Aβ1-42 into the CA1 region of the dorsal hippocampus. As a blank control, seven Ghsr1a+/+mice received an injection of an equal volume of normal saline (NS) into the dorsal hippocampal CA1 region. After one week, the Morris water maze task was simultaneously applied in the three groups to assess the spatial learning and memory capabilities of the mice. Results After 6 d of training, the Ghsr1a+/+ mice with Aβ1-42 injection quickly found the hidden platform, and there was no significant difference in time to the hidden platform between the Ghsr1a+/+ mice with Aβ1-42 injection and with NS injection (P>0.05), indicating that Aβ1-42 injection did not affect spatial learning. The probe test showed that the Ghsr1a+/+ mice with NS injection spent a significantly higher percentage of time in the platform quadrant than in the other three quadrants (F=8.401, q=5.603-7.642, P < 0.01), indicating that these mice acquired normal spatial memory after training. However, for the mice with Aβ1-42 injection, there was no significant difference in the percentage of time between the four quadrants (P>0.05), suggesting that these mice had spatial memory impairment; and the percentage of time spent in the platform quadrant showed no significant difference between the Ghsr1a-/- mice and Ghsr1a+/+ mice with Aβ1-42 injection (P>0.05). Conclusion Injection of Aβ1-42 into the hippocampus impairs the spatial memory of mice but has no effect on the spatial learning. Knocking out the GHS-R1a fails to improve spatial me- mory deficits in Aβ1-42-injected mice.
KEY WORDS: receptors, ghrelin    amyloid beta-peptides    CA1 region, hippocampal    spatial learning    spatial memory    mice    

阿尔茨海默病(AD)是最常见的进行性、神经退行性疾病，主要以β淀粉样蛋白沉积和Tau蛋白过度磷酸化为标志性病理改变。记忆和认知功能减退是AD早期脑功能减退典型的临床表现。与学习记忆密切相关的海马是AD神经退变最敏感的脑区之一[1-4]。海马注射Aβ1-42作为一种简单的造模方法被广泛应用于AD的基础研究[5-7]。GHS-R1a是目前所知的乙酰化ghrelin发挥作用的唯一受体亚型，该受体在中枢神经系统有广泛分布，在下丘脑以及下丘脑以外、与记忆和情绪调节密切相关的脑区(例如海马、皮质和杏仁核等)均有较丰富的表达[8-10]。GHS-R1a对学习记忆的调节作用已有大量报道，但结论并不一致[11-13]。有研究结果表明，外周ghrelin注射能够增加海马CA1区树突棘的密度，促进离体海马脑片的长时程增强，从而提高啮齿动物的学习记忆能力[14]。另有研究指出，海马齿状回多巴胺受体1型(DRD1)介导的场景恐惧记忆和工作记忆的增强均依赖于该区存在的DRD1-GHS-R1a异源二聚体[15]，强调了GHS-R1a独立于配体ghrelin之外对学习记忆的调节作用。但也有研究结果表明，ghrelin及其受体激活对记忆有损害作用[16]。最近的一项研究发现，GHS-R1a敲除小鼠的空间记忆明显优于正常对照小鼠[17]，提示GHS-R1a的激活可能干扰空间记忆的形成。因此，本研究借助海马注射Aβ1-42诱导AD小鼠模型的空间学习和记忆障碍，观察GHS-R1a敲除对模型小鼠空间学习和记忆障碍的可能影响。

1 材料与方法 1.1 实验动物及分组

成年C57BL6J小鼠与GHS-R1a敲除小鼠杂交得到子一代杂合子小鼠，不同笼的杂合子小鼠交配得到子二代GHS-R1a敲除纯合子(Ghsr1a－/－)小鼠以及同窝野生对照(Ghsr1a+/+)小鼠，选用其中3~5月龄雄性小鼠用于本研究。将13只适龄Ghsr1a+/+小鼠随机分为2组，一组小鼠海马注射生理盐水(NS)(Ghsr+/++NS组，n=7)，另一组小鼠海马定位注射Aβ1-42(Ghsr+/++Aβ1-42组，n=6);5只Ghsr1a－/－小鼠海马定位注射等量的Aβ1-42(Ghsr－/－+Aβ1-42组)。

1.2 Aβ1-42的配制

取1 mg Aβ1-42(Sigma公司)溶于1 mL六氟异丙醇(Sigma公司)中，室温静置1 h后冰上静置5 min。将溶液放于通风橱内约2 d，使其彻底风干。然后加入50 μL二甲基亚砜(Sigma公司)，待彻底溶解后再加入0.01 mol/L的PBS溶液。Aβ1-42的终浓度为5 g/L，放于37 ℃恒温箱中老化7 d，－20 ℃储存待用[18]。

1.3 立体定位注射

小鼠按照10 mL/kg体质量腹腔注射40 g/L的水合氯醛和40 g/L的乌拉坦混合溶液，待小鼠麻醉后将其固定于脑立体定位仪上，碘附消毒皮肤后，于两眼连线中点后约5 mm位置切开皮肤，切口长约1 cm。剥离骨膜，暴露前后囟，调整耳杆使小鼠头部位于同一平面。背侧海马CA1区的立体定位坐标为：前囟后1.6 mm、左右旁开2.0 mm、深度2.0 mm[19]。钻孔定位注射Aβ1-42或NS，注射完毕留针10 min，使其充分扩散。缝合皮肤，连续3 d肌肉注射青霉素，术后休息7 d。

1.4 Morris水迷宫实验

该系统由测试圆桶(圆桶分为4个象限：平台象限、对侧象限、左侧象限、右侧象限)、可移动的平台、运动轨迹追踪系统及分析软件4部分组成。实验前在水池内放入增白剂以隐匿平台位置，控制水温在24 ℃左右。实验分为训练和测试两部分，测试动物对平台所在区域的偏好可以反映其空间记忆能力[20]。训练阶段先将小鼠放在平台上30 s，随后于6个入水点的任意一点面朝桶壁将小鼠释放入水，让其寻找水下平台60 s。如小鼠60 s内未找到平台则由实验者将其引导至平台，并让小鼠在平台上再次停留30 s。系统自动记录小鼠的运动轨迹和找到平台的时间，未找到平台的小鼠将时间记作61 s。小鼠每天接受两轮训练，间隔1 h以上，且每次选取不同的入水点将小鼠缓慢释放入水池中，每天训练完成小鼠返回饲养笼。训练天数依据小鼠的学习能力而定，直到正常对照小鼠能够在短时间内迅速找到水下的隐匿平台。训练的第4天开始空间记忆测试，隔天测试1次(如第4天测试时正常对照小鼠未能区分平台象限和其他象限，则第6天再次测试，且第4、5、6天训练照常进行)。测试时，小鼠先在平台上停留60 s，然后撤掉平台，从原平台的对角线位置将小鼠释放入水池。软件自动记录小鼠的运动轨迹、穿越平台象限的次数、探索各个象限的时间百分比等参数，测试时间为60 s。

1.5 统计学分析

应用Graph Pad Prism 6软件进行统计学分析，所得的计量资料数据用x±s表示，多组比较采用双因素方差分析，继以Tukey法进行组间两两比较，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 海马注射Aβ1-42对野生小鼠空间学习和记忆能力的影响

水迷宫训练6 d后，Ghsr1a+/++NS组小鼠可以迅速找到水下的隐匿平台，找到平台的平均时间从最初的(52.11±16.41)s缩短到(19.45±10.55)s(F=10.750，q=5.022，P＜0.01)，表现出正常的空间学习能力。第6天训练结束后的空间记忆测试结果显示，Ghsr1a+/++NS组小鼠在平台象限探索的时间百分比明显高于其他3个象限(F=8.401，q=5.603~7.642，P＜0.01)，表明该组小鼠有良好的空间记忆能力。经过6 d的水迷宫训练，Ghsr1a+/++Aβ1-42组小鼠也可以迅速找到水下隐匿的平台，找到平台的平均时间从最初的(56.84±7.32)s缩短到(27.68±10.63)s(F=10.750，q=5.958，P＜0.01)，表明海马区Aβ1-42注射对小鼠的空间学习无明显影响。但是空间记忆测试的结果显示，Ghsr1a+/++Aβ1-42组小鼠在平台象限的探索时间百分比与其他3个象限相比，差异无统计学意义(P＞0.05)，提示海马脑区Aβ1-42注射可损伤小鼠的空间记忆能力。见表 1、2。

表 1 每天训练各组小鼠找到平台所用时间比较(t/s，x±s)

表 2 第6天水迷宫测试中各组小鼠在各个象限的探索时间百分比比较(χ/%，x±s)
2.2 GHS-R1a敲除对海马Aβ1-42注射诱导的小鼠空间记忆障碍的影响

Ghsr1a－/－+Aβ1-42组小鼠的空间学习受损，在6 d的水迷宫训练中，该组小鼠每天训练找到平台平均时间差异无显著性(P＞0.05)。Ghsr1a+/++Aβ1-42组和Ghsr1a－/－+Aβ1-42组小鼠均不能区分平台象限与其他3个象限，两组小鼠在各个象限的探索时间百分比比较差异均无显著性(P＞0.05);两组小鼠之间比较，在平台象限的探索时间百分比差异也无显著性(P＞0.05)。表明两组小鼠均没有形成关于平台所在空间位置的记忆，即GHS-R1a缺失并不能缓解海马Aβ1-42注射诱导的小鼠空间记忆障碍。见表 1、2。

3 讨论

Ghrelin和GHS-R1a在脑内随衰老、炎症、神经退变等发生动态变化。研究表明，AD病人血中ghrelin浓度明显升高，治疗后降低[21]。与此相一致，AD病人和5xFAD模型小鼠海马内GHS-R1a的表达明显增加[22]，提示GHS-R1a的表达增加与AD认知功能减退呈负相关。本实验室的前期研究显示，基底外侧杏仁核注射ghrelin抑制大鼠条件性味觉厌恶记忆的获取[23]。结合我们及其他实验室的前期研究结果，我们推测GHS-R1a的激活或表达增加抑制学习记忆，而GHS-R1a的缺失可以缓解AD相关的记忆和认知障碍。因此，我们设计了本实验，以探讨GHS-R1a敲除对Aβ1-42模型小鼠空间记忆障碍的可能影响。本文结果显示，GHS-R1a敲除并未改善Aβ1-42注射诱导的小鼠空间记忆障碍，具体原因目前仍不清楚，可能和GHS-R1a以及Aβ1-42的具体作用机制不同相关，又或者在细胞信号传导通路上，Aβ的作用靶点处于ghrelin/GHS-R1a信号通路的下游。总之，本文结果提示GHS-R1a缺失不能对抗Aβ对海马神经元的毒性作用。

Aβ自1985年被发现是脑内淀粉样神经斑块的主要成分后备受关注[24]。大脑内Aβ蛋白异常聚集、形成毒性斑块是AD病人的一个重要特征，多年来聚焦于Aβ靶点探索AD发病机制的研究进展缓慢，这使得人们不得不寻找新的治疗靶点。有研究表明，Aβ蛋白的聚集可能是AD病理性进展起始的关键，而其下游信号如Tau蛋白的过度磷酸化和神经炎性因子激活为神经退行性变的发展提供主要驱动力[25]。在GHS-R1a缺失对认知功能的调控作用中炎性因子激活等事件可能占有重要的地位。接下来我们将借助脂多糖诱导的炎性AD小鼠模型，进一步探讨GHS-R1a敲除对于该模型小鼠认知功能的影响。

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