2020, Vol. 52
胃促生长素(ghrelin)是胃底分泌的由28个氨基酸组成的短肽，是目前已知的唯一一种能够刺激生长激素释放、增强食欲、促进肥胖、增加人和啮齿类动物胰岛素抵抗的外周促食欲激素[1-4]。除在摄食、代谢和能量平衡中发挥关键作用外，近年来越来越多的实验证据表明，血浆中的ghrelin可以通过血-脑脊液屏障进入中枢神经系统，对学习记忆、应激反应、焦虑抑郁、动机奖赏、睡眠等多种重要的脑功能均有复杂的调节作用[5-6]。大量的动物行为学实验结果显示，ghrelin对学习记忆具有促进作用，但到目前为止其作用机制尚不明确[7-13]。海马作为大脑边缘系统的重要结构，是负责学习与记忆的关键脑区[14]。海马分为CA1、CA2、CA3和齿状回(DG)等多个区域，其中CA1、CA2、CA3区的细胞主要为锥体细胞，DG区的细胞主要为颗粒细胞[15]。既往研究结果显示，海马不同区域在信息加工和处理过程中发挥不同的作用，CA1区主要编码时间、空间和位置相关的记忆[14]。因此，本研究利用全细胞膜片钳技术，在离体海马脑片上观察了ghrelin对CA1区锥体神经元兴奋性和抑制性突触传递活动的影响，以揭示ghrelin参与学习记忆调控可能的细胞机制。现将结果报告如下。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物12~20周龄、体质量24~32 g的C57BL/6小鼠，购自上海南方模式生物科技发展有限公司。每笼4只，置于湿度(50±10)%、温度(21±2)℃、昼夜循环光照的环境下饲养，小鼠可自由饮水、取食。实验前小鼠在实验环境中适应至少1周。
1.1.2 试剂① 脑薄片切片液(2.5 mmol/L氯化钾，26 mmol/L碳酸氢钠，1 mmol/L磷酸二氢钠，30 mmol/L D-葡萄糖，119 mmol/L的氯化胆碱，3 mmol/L丙酮酸钠，1 mmol/L犬尿酸，1.3 mmol/L枸橼酸钠，1 mmol/L氯化钙，7 mmol/L硫酸镁，pH值7.2~7.4，渗透压为290~310 mOsm)；②脑薄片恢复液(85 mmol/L氯化钠，25 mmol/L葡萄糖，50 mmol/L蔗糖，1.25 mmol/L磷酸二氢钠，2.5 mmol/L氯化钾，0.5 mmol/L氯化钙，4 mmol/L氯化镁，24 mmol/L碳酸氢钠，pH值为7.2~7.4，渗透压为290~310 mOsm)；③人工脑脊液(ACSF) (120 mmol/L氯化钠，2.5 mmol/L氯化钙，3.5 mmol/ L的氯化钾，1.3 mmol/L硫酸镁，1.25 mmol/L磷酸二氢钠，26 mmol/L碳酸氢钠，10 mmol/L葡萄糖，pH值为7.2~7.4，渗透压为290~310 mOsm)；④电极内液(125 mmol/L的氯化铯，5 mmol/L的氯化钠，2 mmol/L的MgATP，0.2 mmol/L EGTA，2 mmol/L的氯化镁，0.3 mmol/L的Na3GTP，10 mmol/L的HEPES，7 mmol/L的磷酸肌酸，4 mmol/L的QX-314，用1 mol/L氢氧化铯调pH值为7.2~7.4，渗透压为280~290 mOsm)；⑤ghrelin，河鲀毒素(TTX)，犬尿酸，AP-5，picrotoxin。以上所有试剂均购于Sigma和Tocris公司。1.1.3仪器设备振动切片机，Sutter P-97微电极拉制仪，微操纵器，正置显微镜及其成像系统，Axon 700B膜片钳放大器，Digidata 1440数模转换器。
1.2 方法 1.2.1 小鼠离体海马脑薄片的制备12~20周龄小鼠麻醉后用切片液经心脏灌注并断头取脑，在冰水混合的切片液中用切片机沿冠状切面进行连续切300 μm厚的海马脑薄片。电生理记录前先将脑薄片置于恢复液中室温孵育至少1 h，然后随机转入含200 nmol/L ghrelin或对照溶剂的脑片恢复液中继续孵育3 h。切片过程中持续通入含体积分数0.95 O2和体积分数0.05 CO2的混合气使脑片保持健康状态。
1.2.2 海马脑片全细胞膜片钳记录将脑片转移至操作台上，持续灌流通入混合气的ACSF以维持细胞的活性。在光学显微镜下找到海马CA1区神经元胞体高度集中的锥体细胞层进行全细胞膜片钳记录[15-16]。在电压钳模式下分别记录兴奋性突触后电流与抑制性突触后电流，记录过程中电压钳位保持在－70 mV。在ACSF中加入3 mmol/L犬尿酸以分离并记录γ-氨基丁酸(GABA)引起的自发抑制性突触后电流(sIPSCs)，再加入1 μmol/L TTX记录微小抑制性突触后电流(mIPSCs)；在ACSF中加入50 μmol/L的AP-5和50 μmol/L picrotoxin以分离并记录α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙酸(AMPA)引起的自发兴奋性突触后电流(sEPSCs)，再加入1 μmol/L TTX记录微小兴奋性突触后电流(mEPSCs)。实验中，仅对静息膜电位在－55 mV以下的健康神经元的结果进行统计。
1.2.3 统计学分析应用Graph Pad Prism7软件对实验结果进行统计学处理，用Mini Analysis Programm对突触电流的幅度及频率进行分析。所有实验结果均以x±s表示，两组间比较采用成组t检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 Ghrelin对小鼠海马CA1区锥体神经元兴奋性突触后电流的影响在膜片钳显微镜下可以清晰观察到CA1区锥体细胞层神经元排列整齐，胞体似锥形，朝向一致，这些神经元动作电位处于低频发放状态，具有明显的放电频率适应现象，可以确认记录到的神经元为锥体神经元。膜片钳实验结果显示，与溶剂对照ACSF组相比，经200 nmol/L ghrelin孵育后，ghrelin组神经元mEPSCs的幅度增加，差异具有统计学意义(t=2.141，P＜0.05)，而频率没有明显变化(t=0.266，P＞0.05)；sEPSCs的幅度和频率与对照组相比较也均无明显改变(t=1.203、0.729，P＞0.05)。表明200 nmol/L的ghrelin影响小鼠海马CA1区锥体神经元的兴奋性突触传递。见表 1。
| 表 1 Ghrelin对小鼠海马CA1区锥体神经元兴奋性突触后电流的影响(n=12，x±s) |
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膜片钳实验结果显示，两组神经元的sIPSCs和mIPSCs的频率和幅度均无明显差异(t=0.605~1.338，P＞0.05)，表明200 nmol/L ghrelin不影响锥体神经元的抑制性突触后电流。见表 2。
| 表 2 Ghrelin对小鼠海马CA1区锥体神经元抑制性突触后电流的影响(n=12，x±s) |
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大鼠和小鼠的条件性位置回避测试实验发现，在海马内注射ghrelin可剂量依赖性地增强实验动物的位置记忆[17-20]，并且只有在训练前注射ghrelin这种增强作用才能被观察到[17]。也有研究报道，海马内注射ghrlein可增强大鼠的物体识别记忆[18]，皮下注射ghrelin或ghrelin拟似剂LY444711能够增强小鼠的空间记忆[21]。Ghrelin受体缺失小鼠会表现出空间记忆障碍[22]，而外源性ghrelin能够改善ghrelin基因敲除小鼠的物体识别记忆障碍。这些研究均表明，ghrelin对海马依赖的学习记忆有促进作用。关于ghrelin调控学习记忆细胞机制的研究发现，ghrelin能够增强神经元兴奋性[23]，触发海马神经元AMPA受体的突触插入[24]，增大兴奋性突触后电位(EPSP)，增强长时程增强(LTP)的诱导等。然而除了神经元固有兴奋性以及LTP的变化外，突触传递的可塑性变化对记忆编码和记忆环路形成也有重要的作用[25]。
突触是神经元与效应器之间或者两个神经元之间相互接触、并借以传递信息的基本功能单位。兴奋性神经传递主要由离子型谷氨酸受体介导，这些受体包括α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异嗯唑丙酸受体(AMPARs)、红藻氨酸受体(KARs)和N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDARs)。AMPARs是由4种不同的亚单位组成的四聚体或五聚体复合物，是大脑中介导兴奋性突触活动的最主要受体亚型[26]。当突触前膜神经末梢的谷氨酸被释放后，会激活突触后AMPARs和NMDARs，介导阳离子的内流，最终导致内向兴奋性突触后电流并因此引起突触后除极。抑制性突触传递主要由离子型γ-氨基丁酸A(GABA-A)受体介导，突触前末梢释放的GABA与GABA-A受体结合后引起Cl-内流，产生抑制性突触后电流，造成突触后膜超极化。本研究结果表明，200 nmol/L ghrelin增加海马CA1区锥体神经元兴奋性突触传递，对抑制性突触传递没有影响，提示兴奋性和抑制性突触传递之间的不平衡可能是ghrelin影响学习记忆的重要细胞机制之一。Ghrelin对突触传递的影响，在视上核内分泌大细胞中已有报道，研究显示ghrelin可通过调控突触前瞬时受体电位通道(TRPV)增强mEPSCs的频率[27-28]。与之不同的是，我们对海马CA1区锥体神经元的研究显示，200 nmol/L ghrelin不影响mEPSCs的频率，但是能提高mEPSCs的幅度。一般认为，频率代表突触的数目，频率的改变是突触前递质释放的多少导致的，而幅度主要与突触后膜受体的变化相关。由此我们推测，200 nmol/L ghrelin对海马CA1区锥体神经元兴奋性突触传递的调节作用可能主要是通过突触后机制来实现的，可能的机制包括：受体在细胞膜上的数量增多(正向朝膜运输的速率提高或者受体内化的速度下降)或者细胞合成的受体数目增加；也可能是由于受体的电导发生改变，流经单个受体的离子数增多(这种改变可能受到蛋白质修饰影响，例如磷酸化)。但具体机制还有待进一步研究。
综上所述，ghrelin提高小鼠海马CA1区锥体神经元mEPSCs的幅度，而不影响mEPSCs的频率，即ghrelin通过作用于神经元突触后AMPA受体促进兴奋性突触传递从而增强学习记忆。Ghrelin对学习记忆的调控极其复杂，因此尽管研究者们围绕ghrelin的化学结构、分布定位及生理功能等做了大量的研究，但迄今为止，ghrelin参与调控学习记忆的机制并不清楚。Ghrelin与学习记忆之间的相关性研究目前还处于探索阶段，本实验阐明了ghrelin提高小鼠认知功能的部分作用机制，期望能为认知障碍性疾病的治疗提供一定的理论指导。
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