2020, Vol. 56
适度的焦虑对动物与人类的生存具有重要意义，但过度的焦虑则是一种情绪障碍。焦虑症等情感障碍性精神疾病的病因至今仍不清楚，但普遍的观点认为遗传和环境等因素相互作用在焦虑抑郁等情感障碍性精神疾病的发病中占有至关重要的地位。应激刺激是导致焦虑的重要诱发因素。研究表明，内侧前额叶皮质(mPFC)、腹侧海马(vHPC)、基底外侧杏仁核(BLA)、下丘脑(HY)等脑区在焦虑相关行为调控中发挥着重要作用，是重要的焦虑神经环路节点[1-4]。在应激导致焦虑的研究中，反复禁锢应激常被用于急性和慢性焦虑造模，能显著引起小鼠的焦虑样行为[5-11]。本实验室前期研究结果显示，在4 d反复禁锢应激后的7~12 d，小鼠的焦虑样行为表型明显。神经元受到外界刺激后会迅速表达c-Fos，c-Fos蛋白的表达通常被认为是神经元活动的重要标志[12]。张颀等[13]以c-fos为探针研究显示，强迫游泳后C57BL/6小鼠的mPFC、杏仁核、伏隔核被激活。既往研究观察的多是应激后c-Fos的急性表达，而对于焦虑状态下c-Fos在不同脑区的表达鲜有报道。因此，本研究拟观察4 d反复禁锢应激后90 min及7 d时小鼠mPFC、HY、vHPC、BLA脑区c-Fos的表达情况，旨在探讨反复禁锢应激对小鼠焦虑相关脑区c-Fos表达的影响，以及c-Fos表达与焦虑样行为之间的相关性。
1 材料与方法 1.1 实验动物及主要试剂实验动物为2月龄雄性C57BL6/J小鼠12只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养条件为温度(21±2)℃、湿度(50±10)%、12 h/12 h昼夜等长循环光照，小鼠可自由饮水、进食。小鼠适应实验室环境至少1周后进行实验。c-Fos一抗为c-Fos(9F6)Rabbit mAb#2250，购自美国Cell Signaling Technology公司; c-Fos二抗为Alexa-568 goat anti-rabbit，购自美国Invitrogen公司。
1.2 动物分组及处理实验前将小鼠随机分为对照组(A组)、禁锢后90 min组(B组)和禁锢后7 d组(C组)，每组4只。对3组小鼠进行高架十字迷宫行为学测试，检测其基础焦虑水平。B组和C组小鼠进行连续4 d的反复禁锢应激，分别于4 d禁锢后90 min和禁锢后7 d再次进行高架十字迷宫测试，然后立即进行灌注取脑。A组小鼠不做任何处理，直接从饲养笼中取出进行灌注取脑。整个实验过程中3组小鼠均正常饲养，没有出现小鼠缺失的情况。
1.3 反复禁锢应激将小鼠用异氟烷轻度麻醉后放置于禁锢器中1 h，禁锢时间为每天下午14:00—15:00，连续禁锢4 d。禁锢器是两端均可拆开的圆筒状物，材质为有机玻璃，透明且通风透气良好。被放于禁锢器中的小鼠无法移动，不可掉头。
1.4 高架十字迷宫实验实验装置由十字迷宫、视频采集系统及分析系统3部分组成。高架十字迷宫是由两个开放臂、两个闭合臂及一个中心区组成。测试时，将小鼠从中心区释放入迷宫，让小鼠在高架十字迷宫中自由活动10 min。通过Noduls自动分析系统记录小鼠在开放臂、闭合臂、中心区各个区域的探索时间以及进出开放臂和闭合臂的次数。
1.5 c-Fos免疫荧光染色和免疫阳性细胞计数用生理盐水和新配制的40 g/L多聚甲醛对小鼠进行心脏灌注，取脑放入4 ℃多聚甲醛中固定6 h，然后转入300 g/L蔗糖溶液中至沉淀。用恒冷箱冷冻切片机切片(厚度40 μm)，放入0.01 mol/L的PBS溶液中。小鼠的脑切片用体积分数0.04的山羊血清封闭液封闭1 h，加c-Fos一抗(1:3 200)在4 ℃摇床中孵育72 h，孵育后以PBS溶液冲洗3次，每次10 min。然后加荧光二抗(1:500)孵育2 h，以PBS清洗3次，每次15 min。洗完后用封片剂ProLong® Gold Antifade Reagent(美国Invitrogen公司)封片。根据小鼠脑立体定位图谱(第2版)明确区分4个目的脑区，用OLYMPUS全自动虚拟切片扫描系统(VS120)对目的脑区的荧光图像进行扫描拍摄(20倍干物镜)。使用Image J软件的图像阈值测量工具对目的脑区感兴趣区域(ROI)的c-Fos免疫阳性细胞进行计数。每组任选3只小鼠的脑切片行免疫荧光染色，每只小鼠选取4个有代表性的目的脑区染色切片进行图像采集，每张图像上选取3个不同的ROI进行细胞计数。选取ROI的大小为1 mm2。
1.6 统计学分析实验结果以x±s形式表示，应用Graph Pad Prism 6.0软件对其进行统计学分析。B、C组小鼠禁锢前后在高架十字迷宫开放臂停留时间及进入开放臂次数的比较采用配对t检验; 3组小鼠各脑区c-Fos免疫阳性细胞数的比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，并继以Dunnett法比较B、C组与A组的差异，用Tukey法比较B、C组的差异。P＜0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 高架十字迷宫实验B组小鼠禁锢前后在开放臂的停留时间和进入开放臂的次数差异均无显著意义(P＞0.05);C组小鼠禁锢后在开放臂的停留时间较禁锢前明显缩短，进入开放臂的次数较禁锢前明显减少，差异均有统计学意义(t=3.364、6.386，P＜0.05)。见表 1。
| 表 1 各组小鼠在开放臂停留时间及进入开放臂次数比较(n=4, x±s) |
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B组各脑区c-Fos免疫阳性细胞数较A组明显增加(F=13.4~645.0，q=5.1~31.6，P＜0.01);C组HY和BLA脑区c-Fos免疫阳性细胞数亦较A组明显增加(q=3.0、3.0，P＜0.05)，但mPFC和vHPC脑区c-Fos免疫阳性细胞数与A组相比差异无显著性(P＞0.05); B组mPFC、BLA及vHPC脑区c-Fos免疫阳性细胞数与C组比较明显增加，差异有统计学意义(q=13.8~43.3，P＜0.01)，但HY脑区c-Fos免疫阳性细胞数的增加并不明显(P＞0.05)。见表 2。
| 表 2 各组小鼠不同脑区c-Fos免疫阳性细胞数的比较(n=3, x±s) |
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常用的动物焦虑抑郁模型主要包括应激模型、药理学模型、分养模型及脑组织损伤模型等。作为一种经典的单一性应激源焦虑模型，反复禁锢应激可明显诱发小鼠的焦虑表型。虽然不同的研究中，每天应激时长及应激持续天数各不相同，但小鼠焦虑表型明显的这段时间通常被认为是焦虑态时间窗[14-16]。本研究应用的是连续4 d反复禁锢亚急性应激模型。我们的前期研究显示，在禁锢后的7~12 d，小鼠的焦虑表型明显，即这段时间为小鼠的焦虑表型时间窗，而4 d禁锢刚结束时，小鼠仍处于应激状态，其焦虑表型并不明显。本研究借助高架十字迷宫实验，对各组小鼠的焦虑水平进行了测试。结果显示，与对照组小鼠相比，反复禁锢后7 d，小鼠表现出明显的焦虑样行为，即在开放臂的停留时间明显缩短，进入开放臂的次数也明显减少; 而反复禁锢后90 min小鼠在开放臂的停留时间及进入开放臂的次数仅有缩短或减少的趋势，与对照组相比差异无显著性。
c-Fos蛋白是即刻早期基因c-fos转录翻译的产物，是一种核内磷酸化蛋白。基础状态下，c-Fos蛋白在中枢神经系统的表达水平非常低甚至无表达，而在各种应激刺激后，c-Fos蛋白的表达能够被快速诱导。在应激后的1~2 h，c-Fos蛋白的表达达到高峰，然后逐渐衰减[17]。中枢神经系统内c-Fos蛋白的表达依赖于应激源的内在特性、强度和持续时间。由于c-Fos蛋白的表达能在很大程度上反映刺激诱导的神经元活动，故常被作为神经元激活的标志物[18]。本研究应用免疫荧光技术检测了各组小鼠不同脑区c-Fos的表达情况，结果显示，反复禁锢后90 min，小鼠mPFC、HY、BLA及vHPC这4个焦虑相关脑区c-Fos的表达水平与对照组相比均明显增加，而反复禁锢后7 d小鼠仅HY和BLA脑区c-Fos的表达显著高于对照组，mPFC和vHPC脑区c-Fos表达虽有增加的趋势，但差异无统计学意义。这与相关文献描述的c-Fos蛋白的表达变化情况一致[17]。值得注意的是，本研究还显示，反复禁锢后7 d小鼠的焦虑样表型明显，同时c-Fos蛋白在HY和BLA脑区仍有较高的表达，提示这两个脑区更有可能参与反复禁锢应激后焦虑情绪的调节，从而与小鼠的焦虑样行为密切相关。
以往的相关研究多采用急性应激刺激，包括电击、空瓶刺激、强迫游泳、寒冷、次声、急性社交挫败等[19-24]。急性应激刺激诱发的c-Fos表达部位涉及额叶皮质、扣带皮质、中央杏仁核、前连合核、下丘脑背内侧核弥散部、下丘脑室旁核、室周核、弓状核、孤束核、丘脑外侧备核、伏隔核、终纹床核等。慢性应激后，c-Fos的表达部位主要涉及下丘脑室旁核、室周核、弓状核、vHPC、背侧海马、mPFC、杏仁核、前扣带皮质、纹状体、伏隔核等[22, 25-28]。本研究应用的是4 d反复禁锢亚急性应激方式，实验结果显示，4 d反复禁锢应激诱导的c-Fos在目的脑区均有表达，提示这种持续时间在2周以内的亚急性应激刺激诱导的c-Fos表达脑区分布更接近于以往报道的慢性应激刺激。另外，本研究在高架十字迷宫测试结束后立即进行灌注取脑，因此十字迷宫测试本身不会引起c-Fos蛋白的表达。
综上所述，4 d反复禁锢应激可诱导小鼠HY和BLA等焦虑相关脑区c-Fos表达的持续增加，并与小鼠的焦虑样行为表型密切相关，提示这些脑区可能参与了反复禁锢应激后焦虑情绪的调节。本实验为后续深入研究上述核团参与焦虑相关行为调控的突触和神经环路机制提供了重要的实验依据，并为创伤后应激障碍等应激障碍性精神疾病的治疗提供了理论基础。
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