下呼吸道感染是临床常见的呼吸系统严重的感染性疾病，是目前导致人类死亡的四大主要原因之一^[1]，不能及时获得正确的诊断和治疗是导致其病死率居高不下的主要原因。传统的病原体分离培养法是诊断下呼吸道感染的“金标准”，但其存在培养时间长、敏感性低、对苛养菌漏检率高等缺陷^[2]，不能满足临床对感染的快速诊断需要。近年来生化及免疫学检验领域的发展对下呼吸道感染性疾病的快速诊断起到了良好的推动作用，但这些检查方法仍存在敏感性低和特异性不高等缺点^[3]。分子生物学技术因高效、特异和敏感等特性已被广泛应用于临床对多种疾病的诊断中。作为分子生物学技术的代表性方法，聚合酶链反应(PCR)技术可快速鉴定病原体，且多重PCR技术可以对多种病原体同时进行筛检^[4]。然而，PCR检测需要分子生物学实验室配备高度精密的仪器，价格昂贵，而且操作复杂。近年来出现的一种新的核酸检测方法——环介导恒温扩增(LAMP)芯片法，可同时检测13种病原体，其特异性强、敏感性高，检测快速准确、操作简单，对技术水平要求相对较低，所需实验器材简单，被广泛应用于感染性疾病的诊断中。本研究旨在通过对疑似下呼吸道感染病人的深部痰液及肺泡灌洗液标本进行LAMP检测，评价该方法的临床应用价值。

1 材料与方法 1.1 标本及其来源

研究对象为2017年1—12月在我院就诊的疑似下呼吸道感染病人2 029例。病人均来源于烟台和威海地区，其主要临床表现为发热、咳嗽咳痰，伴或不伴胸痛及呼吸困难，查体呼吸音粗糙，伴或不伴干/湿性啰音，胸部X线片或胸部CT扫描等影像学检查提示下呼吸道感染。其中，男性1 179例，女性850例; 年龄0~97岁。收集2 029例病人自然咳出的深部痰液标本和246例病人的肺泡灌洗液标本。痰液标本的合格标准：多形核白细胞＞25/低倍镜视野(LP)，鳞状上皮细胞＜100/LP。肺泡灌洗液标本的合格标准：＜1%的细胞为鳞状上皮细胞。

1.2 试剂及仪器

LAMP芯片法试剂盒及RTisochip^TM-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪均购自北京博奥晶典生物技术有限公司; 病原体分离培养所用的试剂及VITEKⅡ-Compact细菌鉴定仪均购自法国梅里埃生物公司。

1.3 检测方法 1.3.1 LAMP芯片法

① 核酸提取：痰液经40 g/L的NaOH溶液充分消化，振荡混匀后室温下静置20 min，以13 000 r/min离心5 min，弃上清，向沉淀中加入核酸提取液并吹打混匀。将悬液转移入核酸提取管中，加入玻璃珠，振荡20 min后于95 ℃金属浴放置5 min，离心。②配制核酸反应体系：从冰箱中取出恒温扩增试剂在室温下解冻，轻摇充分混匀后瞬时离心至试剂管管底。吸取20.0 μL恒温扩增试剂，加入34.5 μL被检核酸样品，每份核酸扩增反应体系的总体积为54.5 μL。③芯片加样：打开RTisochip^TM-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪，吸取50 μL上述配制好的核酸扩增反应体系，加入到芯片主通道中后运行仪器，结果用相应软件进行分析。④结果判读：每次实验分别设置阴性和阳性对照，实验结果以荧光曲线形式体现，其中扩增曲线呈“S”型即判定为阳性，扩增曲线呈水平直线者即判定为阴性。

1.3.2 病原体分离培养

接种培养及菌种鉴定遵循呼吸道病原微生物操作标准(WS/T499-2017)进行，培养后取可疑菌落使用法国梅里埃VITEKII-Compact全自动细菌鉴定仪进行鉴定。

1.4 统计学处理

采用SPSS 22.0软件进行数据的统计处理。计数资料用率表示，组间比较采用卡方检验; 两种方法检测结果的一致性分析采用Kappa分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 LAMP芯片法阳性检出率

在痰液标本中，LAMP芯片法检测的总阳性率为57.96%(1 176/2 029)。检出病原体以流感嗜血杆菌为主，阳性率为21.24%(431/2 029);其次为肺炎链球菌以及肺炎支原体，阳性率分别为16.46%(334/2 029)和14.14%(287/2 029);鲍曼不动杆菌、嗜肺军团菌、结核分支杆菌复合群、肺炎衣原体阳性率均较低。在肺泡灌洗液标本中，LAMP芯片法检测的总阳性率为33.33%(82/246)。检出病原体以肺炎支原体为主，阳性率为20.73%(51/246);其次为肺炎链球菌、结核分支杆菌复合群、铜绿假单胞菌，阳性率分别为6.91%(17/246)、4.88%(12/246)、4.77%(11/246);其他病原体阳性率均较低。不同类型标本呼吸道病原体阳性率存在差异。见表 1。

2.2 不同性别病人LAMP芯片法检测阳性率比较

在痰液标本中，男性和女性病人检出病原体均以流感嗜血杆菌为主，差异无显著性(P＞0.05);女性病人肺炎支原体阳性率显著高于男性病人(χ²=10.228，P＜0.05)，而肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌阳性率显著低于男性(χ²=5.558、6.247，P＜0.05)。见表 2。

2.3 不同年龄病人LAMP芯片法检测阳性率比较

根据世界卫生组织(WHO)2016年年龄分类标准^[5]，将病人分为少年组(＜18岁)、青年组(18~44岁)、中年组(45~59岁)和老年组(＞59岁)。不同年龄组病人痰液标本LAMP芯片法检测阳性率比较见表 3。由表 3可知，各年龄组间比较，流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、肺炎支原体检测阳性率少年组高于其他年龄组，金黄色葡萄球菌、结核分支杆菌复合群检测阳性率以青年组最高，肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌及嗜麦芽窄食单胞菌检测阳性率随年龄的增大而增高，大肠埃希菌检测阳性率老年组高于其他组，差异均具有统计学意义(χ²=11.445~148.189，P＜0.05)。流感嗜血杆菌阳性率在各年龄组均较高。

2.4 两种方法检测结果的一致性分析

在痰液标本中，普通培养法检测的总阳性率为10.50%(213/2 029)，与LAMP芯片法比较差异具有统计学意义(χ²=101.511，P＜0.01)。LAMP芯片法与培养法检出病原体共同阳性174例，LAMP芯片法检出阳性而培养法阴性1 559例，两种方法检测结果一致性见表 4。在13种病原体中，两种方法检出铜绿假单胞菌的一致性最高(Kappa=0.651，95%CI=0.561~0.741)。

3 讨论

下呼吸道感染是一个全球范围的严重公共卫生问题，它常为多种呼吸系统疾病的诱因，并涉及种类繁多的病原体。目前，在短时间内做出明确的病原学诊断并进行有针对性的治疗依然很困难，这也是该病死亡率高的主要原因^[6]。实践证明，定期或者不定期地对呼吸道疾病的流行病学特征进行统计分析，可以为疾病预防控制提供干预依据^[7]。预防为主、准确诊断、及时治疗，是防治该病的基本原则，而明确引起感染的病原体和针对性药物的选择配伍则是降低该病死亡率的重要保证。下呼吸道感染多由细菌、病毒、支原体、衣原体等病原体引起^[8]，受目前技术所限，除细菌外的其他病原体的常规培养，临床微生物室尚难以开展。因此，一种特异性高、覆盖面广、检测灵敏快速的病原体诊断方法——LAMP技术应运而生。

2000年，这种以链置换酶核酸扩增为基础的LAMP被NOTOMI等^[9]首次报道。LAMP利用针对6个靶基因区域而设计的4对特异性引物，通过链置换DNA聚合酶在恒温条件下(65 ℃左右)，形成一系列不同大小的具有多个靶DNA反向重复串联序列的产物。该方法不需要传统PCR的严苛条件和观察步骤，整个反应过程仅需15~60 min即可完成^[10]。LAMP从标本处理到报告结果全过程仅需2 h，尤其适用于基层医院及军队野战医院，故一经报道就受到了广泛的关注^[11]。LAMP的特异性和敏感性很高，操作及检测方法简单，且芯片法检测结果不易出现污染、自动化程度高、试剂损耗低、检测病原体覆盖面广，具备了对呼吸道感染性疾病的快速诊断能力^[12]。

本研究以商品化LAMP试剂盒对疑似下呼吸道感染病人的标本进行了13种病原体的检测，结果表明，流感嗜血杆菌是最主要下呼吸道致病菌，其次为肺炎链球菌和肺炎支原体，该结果与我院同期微生物室呼吸道标本分离细菌分布情况大致相同，但与同年全国细菌耐药监测网发布的数据略有差异。这可能与地域差异有关; 另外，由于流感嗜血杆菌对环境的要求较为严格，采集及运输方式不当，对培养阳性率的影响也较大^[13]。本研究中，女性病人肺炎支原体的阳性率较男性高，而男性病人肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌的阳性率高于女性。这可能与女性和男性的生理及免疫差异有关，具体机制尚需进一步研究。各年龄组间比较，8种下呼吸道病原体阳性率差异有统计学意义，提示下呼吸道病原体感染与年龄有一定的关系。这与郑才玲等^[14]的报道较为一致。流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、肺炎支原体的阳性率在少年组最高，这与少年人群免疫系统发育尚不成熟，且长期活动于学校等人群密集度较高的场所，呼吸道病原体的传播更容易且迅速，从而导致相关病原体阳性检出率偏高^[15]。肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌阳性率则在老年组最高，这与老年病人基础疾病多、住院率高、院内感染率高有关。深部痰液和肺泡灌洗液检出的病原体种类及阳性率均存在明显差异，肺泡灌洗液中流感嗜血杆菌的检出率较低，而肺炎支原体的检出率较高。这可能是由于不同病原体的定植位置不同而导致的，肺炎支原体常黏附于肺泡上皮细胞上，通过肺泡灌洗后能于灌洗液中富集，因此检出率会更高^[16]; 而流感嗜血杆菌等常定植于上呼吸道，因此通过自然咳痰的方法更易被检出^[17]。

LAMP芯片法对某些苛养菌(如肺炎链球菌和流感嗜血杆菌等)的检出率比常规培养法更高，对支原体等难以常规培养的病原体更有培养法所无法比拟的优势。由于抗生素的广泛使用，很多病人在留取标本前可能已经使用了某些抗生素，这会对培养的阳性率造成严重影响; 另外，某些病原体对培养条件要求苛刻，需要特殊的培养基才能生长，培养困难或根本无法培养，这也是造成培养阳性率低的一大因素。如流感嗜血杆菌培养条件特殊，X因子(正铁血红素)、V因子(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)是其生长的必须因子，临床分离、培养时巧克力平板的V因子在常温或高温下容易失去活性，导致流感嗜血杆菌在培养基上生长差或不生长，经常被漏检^[18]。肺炎链球菌在体外生存能力较弱，对培养的营养要求高，可产生自溶酶，在经验不足的基层实验室中使用普通培养基或涂片革兰染色检查可将其与草绿色链球菌混淆，培养和菌种菌型鉴别过程复杂，导致培养法阳性率较低^[19]。LAMP技术可从标本极其微量的核酸中获取目的基因^[20]，并进行扩增和放大，灵敏度较普通培养法有质的提高。本研究结果还显示，两种方法的诊断一致性较好，尤其是对铜绿假单胞菌的检出一致性最高，Kappa值可达0.651。由于婴幼儿的依从性较差，合格的痰培养标本难以获取，因此病原体阳性检出率低是困扰婴幼儿下呼吸道感染诊断的关键问题^[21]。LAMP技术由于采用了特异性引物进行扩增，在保证了高度特异性的前提下^[22]，大大提高了检出阳性率，这使得该技术在婴幼儿下呼吸道感染病原体诊断方面具有绝对的优势。LAMP芯片法还可对结核分支杆菌复合群、军团菌^[23]、衣原体这3种无法常规培养的病原体同时进行检测，可使病原体的覆盖面更广，大大提高了诊断的灵敏度^[24]。本研究中检出军团菌4例，结核分支杆菌复合群28例，衣原体10例。28例结核分支杆菌复合群中，17例抗酸杆菌涂片阴性，我们又对扩增产物进行了测序验证，符合率100%，病人抗结核治疗有效。表明LAMP芯片法可以帮助临床快速诊断下呼吸道感染并指导临床合理用药。

综上所述，本研究采用LAMP芯片法检测了本地区疑似下呼吸道感染病人的病原体分布情况，结果显示病原体以流感嗜血杆菌为主，与同期全国细菌耐药监测网发布的数据略有差异; 该方法可对下呼吸道感染病人痰液及肺泡灌洗液中的病原体，尤其是苛养菌和不可培养病原体进行快速检测，检出阳性率明显高于传统培养法。LAMP芯片法操作简单，可同时检测多种病原体，适宜在基层医院中推广和应用。