2. 青岛大学附属医院检验科, 山东 青岛 266034;
3. 青岛大学附属医院医学遗传科, 山东 青岛 266034;
4. 青岛市市立医院检验科, 山东 青岛 266034
子痫前期(PE)是一种妊娠期特发性疾病, 可以伴有多种脏器的功能损害[1], 其发病率在初产妇为3.0%~7.0%, 经产妇为0.8%~5.0%, 严重威胁着母儿的生命健康[2]。PE的发病机制至今尚未完全阐明, 但研究表明其发病与炎症反应、氧化应激、免疫失衡、遗传因素等有关[3-8]。系统性炎症反应和氧化应激状态会诱导热休克蛋白70 (HSP70)表达升高[9]。并且, PE病人血清、血浆以及胎盘组织中都有高水平的HSP70表达[10]。已有研究证实, 多种基因的单核苷酸多态性(SNPs)与PE发病及遗传易感性具有密切关系[11-12]。本研究选取HSP基因中一个标签位点rs2227956, 探讨其多态性与PE遗传易感性的相关性, 旨在为PE的临床诊断及治疗提供遗传学依据。现将结果报告如下。
1 资料与方法 1.1 一般资料选取800例已经确诊的PE病人作为病例组, 1 000例足月分娩的正常孕妇作为对照组, 两组年龄匹配, 且均来源于2016年10月—2018年10月在青岛大学附属医院、烟台毓璜顶医院、滨州医学院附属医院、聊城市人民医院、临沂市人民医院、枣庄市妇幼保健院、菏泽市立医院等山东各地医院产科住院的中国汉族妊娠妇女。PE的诊断标准参照美国“国家高血压教育计划”[13], 分度及分型参考相关文献标准[14-15]。其中轻度PE病人181例, 重度PE病人619例; 早发型PE病人426例, 晚发型PE病人374例。对照组为没有PE病史、足月分娩、产后随访亦未发生PE的正常孕妇。两组孕妇均排除前置胎盘、胎膜早破、先兆流产、辅助生殖、巨大儿及双胎妊娠, 均无慢性高血压、心脏病、肾病、糖尿病、甲状腺疾病以及系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等全身性疾病病史。
两组孕妇临床资料均完整, 包括年龄、月经初潮年龄、妊娠次数、流产次数、收缩压、舒张压、入院孕周、分娩孕周、临床症状以及实验室检查指标等, 且所有研究对象均签署知情同意书。本研究获青岛大学附属医院伦理委员会批准。
1.2 研究方法采集研究对象外周肘静脉血2 mL于EDTA抗凝管中, 用试剂盒提取基因组DNA, 然后采用TaqMan探针实时荧光PCR技术对HSPA1L基因rs2227956位点多态性进行检测。PCR反应体系包括:20×SNP探针1.25 μL, 2×PCR MasterMix 12.5 μL, 模板DNA和去除DNA酶水11.25 μL, 总反应体系共25 μL。实验所用探针、引物及MasterMix均购买于美国ABI公司。其中rs2227956位点上游引物序列为5′-AATGGTATTCTCAATGTCACAGCCA-3′, 下游引物序列为5′-GGACAAGAGCACCGGCAAGGTGAAC-3′。PCR循环条件:95 ℃预变性3 min; 95 ℃、15 s, 60 ℃、1 min, 共45个循环, 在C1000TM热循环仪和CFX96TM实时系统(Bio G Rad, California, USA)中进行扩增反应。最后通过Bio Rad CFX manager 3.0软件读取基因型。
1.3 统计学分析使用SPSS 21.0软件进行统计分析, 应用拟合优度χ2检验进行Hardy-Weinberg(HWE)遗传平衡分析, 计量资料比较采用Student’s t检验, 两组间基因型频率及等位基因频率的比较采用Pearson’s χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 两组一般基础资料比较病例组和对照组入院孕周、分娩孕周、新生儿体质量和血压比较差异有显著意义(t=-38.603~78.883, P<0.01), 而年龄、月经初潮年龄、孕次和流产次数差异均无统计学意义(P>0.05)。见表 1。
对照组HSPA1L rs2227956位点的基因型分布和等位基因频率均符合HWE遗传平衡定律(χ2=2.671, P=0.102), 说明该研究所选取样本具有群体代表性。病例组与对照组相比, 基因型分布差异无统计学意义(χ2=0.901, P=0.637), 等位基因频率差异亦无统计学意义(χ2=0.286, P=0.593, OR=0.956, 95%CI=0.813~1.126)。见表 2。
轻度PE病人与对照组、重度PE病人与对照组基因型分布与等位基因频率比较差异均无统计学意义(轻度PE与对照组基因型分布比较, χ2=0.085, P=0.958;等位基因频率比较, χ2=0.090, P=0.764, OR=1.043, 95%CI=0.794~1.370。重度PE与对照组基因型分布比较, χ2=1.495, P=0.474;等位基因频率比较, χ2=0.613, P=0.434, OR=0.932, 95%CI=0.781~1.112)。见表 2。
2.4 早发型、晚发型PE组与对照组基因型分布和等位基因频率的比较早发型PE组与对照组、晚发型PE组与对照组基因型分布与等位基因频率比较差异亦均无统计学意义(早发型PE与对照组基因型分布比较, χ2=0.956, P=0.620;等位基因频率比较, χ2=0.810, P=0.368, OR=0.912, 95%CI=0.746~1.115。晚发型PE与对照组基因型分布比较, χ2=0.701, P=0.704;等位基因频率比较, χ2=0.006, P=0.936, OR=1.008, 95%CI=0.820~1.240)。见表 2。
3 讨论PE是一种以高血压和蛋白尿为特征的妊娠期特发性疾病, 可累及肝、肾、胎盘、神经系统及血液系统等多种脏器和系统, 严重危及母婴的生命安全[1]。该病发病机制不明。越来越多的研究表明, 炎症反应和氧化应激在PE发生发展中具有重要作用[6-8]。妊娠会使孕妇处于一种普遍的适度的炎症反应状态, 而PE病人处于一种过度的炎症反应状态[16]。并且, PE病人血清中的IL-1β、IL-2、IL-6和IFN-γ等炎症因子水平比正常孕妇明显升高[17-19]。氧化应激是指体内氧化系统与抗氧化系统失衡, 导致活性氧增多[20-21], 通过一系列病理生理变化参与PE的发生发展[22]。
热休克蛋白(HSP)是热休克反应中转录合成的一组蛋白, 可以增强细胞对应激的耐受性, 稳定细胞蛋白内环境[23]。迄今为止, HSP有3大家族被广泛研究:低分子量HSP家族、HSP70家族、HSP90家族[24]。其中HSP70是含量最丰富的一类, 其保守性和可诱导性最强。HSP70是重要的分子伴侣, 对于维持细胞的正常机制是必不可少的, 其具有参与蛋白质折叠、介导细胞自我保护、抗细胞凋亡以及调节免疫反应等作用[25-26]。已有研究结果证实, 系统性炎症反应和氧化应激状态会诱导HSP70表达升高[9, 27], 并且, PE病人的血清、血浆以及胎盘组织中HSP70表达也升高[10]。此外, 研究还发现HSP70与高血压及相关疾病的发病机制相关[28]。
人体中编码HSP70家族成员的基因共有3个:HSPA1A、HSPA1B以及HSPA1L, 它们均位于6p21.3[29]。其中HSPA1A和HSPA1B编码同一种蛋白热休克诱导性蛋白产物, 而HSPA1L编码非热休克诱导性蛋白产物, 两种蛋白产物有90%的氨基酸序列相同[30]。研究发现多种基因与PE发病相关, 具有遗传易感性, 包括Survivin基因、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因、V Leiden因子基因、血管紧张素转换酶(ACE)基因、亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因以及肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因等, 这些不同基因的SNP位点多态性影响着PE的发病及遗传易感性[11]。由于HSPA1L编码的蛋白产物HSP70与炎症反应、缺血低氧、氧化应激等参与PE发生发展的重要因素密切相关, HSP70在PE病人的血清、血浆以及胎盘组织中表达也升高, 提示HSP70在PE的发生发展中起一定的作用; HSP70与高血压及相关疾病的发病机制相关; PE的发病还与多种基因相关, 具有遗传易感性, 推测编码HSP70蛋白的基因HSPA1L可能与PE发病有关。本文选取了HSPA1L基因中一个标签性SNP位点rs2227956进行研究, 探讨HSPA1L基因rs2227956位点的多态性与PE的遗传易感性是否具有相关性, 旨在为PE的临床预测以及治疗提供遗传学依据。
本文研究结果显示, PE组病人和正常对照组HSPA1L rs2227956位点的基因型分布和等位基因频率差异无显著性。为进一步探讨该位点与PE遗传易感性关系, 将PE组孕妇分为轻度、重度PE以及早发型、晚发型PE, 并进行分析, 结果显示, 轻度、重度PE病人与对照组比较以及早发型、晚发型PE病人与对照组比较, HSPA1L rs2227956位点的基因型分布和等位基因频率差异均无显著性。表明HSPA1L rs2227956位点的多态性在PE的发生发展中可能并不起关键性作用, 尚不能认为该位点的多态性与PE的遗传易感性相关。
本文研究结果可能会受多种因素的影响。首先, 研究对象均来自于山东省汉族人群, 因此本文研究结果不适用于其他地区、其他人群或人种; 其次, 由于PE是一种复杂的多基因遗传性疾病, 可能会受多种基因、多个位点的共同作用或相互作用的影响; 另外, 环境因素也可能会影响研究结果。因此, 还需要更多地区、更多种族人群、更多基因位点、纳入环境因素影响甚至功能性的研究, 来进一步验证本研究的结果, 加深对PE发病的认识, 以便更好地指导其临床诊断和治疗。
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