帕金森病(PD)是一种常见的神经退行性疾病, 其主要临床表现为静止性震颤、肌僵直、运动迟缓和姿势反射异常等^[1-2]。有研究结果表明, 铁沉积和氧化应激是PD的两个主要的病理特征^[3-4]。铁对于细胞发育和维持中枢神经系统的各个生理过程至关重要, 例如氧气运输、DNA合成、线粒体呼吸、髓磷脂合成和神经递质代谢等^[5-6]。少突胶质细胞是中枢神经系统中形成髓鞘的细胞, 它是由少突胶质细胞前体细胞(OPCs)分化而形成的^[7-8]。铁蛋白是中枢神经系统中的主要储存蛋白, 且在少突胶质细胞中检测到最高表达水平。因此, 少突胶质细胞也是中枢神经系统中重要的铁调节细胞^[9-11]。4-b-佛波醇-12-豆蔻酸-13-乙酸酯(PMA)是一种广泛用于体内外实验的蛋白激酶C(PKC)激活剂, 它可以结合PKC, 并激活PKC, 随后导致一系列的细胞反应。有研究结果表明, 未分化的MO3.13细胞在加入含100 nmol/L的PMA的无血清培养液中培养7 d后, 检测到髓磷脂碱性蛋白(MBP)的免疫反应性大幅度上调^[12]。然而, PMA是否影响少突胶质细胞内铁相关蛋白的表达, 目前仍不清楚。本实验旨在探讨PMA对MO3.13少突胶质细胞内铁相关蛋白表达的影响, 从而为PD的防治提供实验依据。现将结果报告如下。

MO3.13少突胶质细胞购自于上海拜力生物科技有限公司。DMEM高糖培养基、胰酶均购自美国Hyclone公司, 胎牛血清(FBS)购自Gibco公司, PMA、兔抗属单克隆一抗转铁蛋白受体1(TfR1)和铁调节蛋白1(IRP1)均购自Sigma公司, 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗购自Absin公司, 青霉素-链霉素溶液(100×)购自江苏海门碧云天生物技术研究所, BCA蛋白定量检测试剂盒为Thermo公司产品。所使用的仪器包括CO₂培养箱、超净工作台和Western显影仪等。

将放置在液氮中的未分化MO3.13少突胶质细胞冻存管快速转移至37 ℃恒温水浴锅中进行融化。在超净工作台中将融化的未分化MO3.13少突胶质细胞从细胞冻存管中吸出, 转至离心管中, 再补入10 mL的MO3.13少突胶质细胞完全培养液, 用于稀释冻存液中的有害成分。将离心管放于离心机中, 以1 000 r/min离心5 min, 沉淀细胞。弃上清, 重新加入细胞培养液, 用滴管吹打细胞后转入细胞培养瓶中, 置于37 ℃、含体积分数0.05 CO₂的细胞培养箱中培养。当培养瓶中的细胞长至90%融合时, 将细胞接种于6孔细胞板中, 用MO3.13少突胶质细胞完全培养液培养24 h, 将原有的细胞培养液弃掉, 加入含100 nmol/L PMA的无血清培养液, 置于37 ℃、含体积分数0.05 CO₂的细胞培养箱中培养。每3 d换1次液, 培养7 d后, 采用免疫荧光摄片的方法检测到成熟少突胶质细胞的标记物MBP的表达率大于90%, 证明未分化的MO3.13少突胶质细胞分化成分化的MO3.13少突胶质细胞。本实验将细胞分为对照组(未分化的MO3.13少突胶质细胞)和PMA组(分化的MO3.13少突胶质细胞)。

提取两组细胞蛋白, 用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度, 根据蛋白浓度计算每个样本的上样量。蛋白经SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜上, 采用100 g/L的脱脂奶粉室温封闭2 h, 再分别加入β-actin(1:10 000)、TfR1(1:1 000)和IRP1(1:1 000)抗体, 4 ℃下在摇床上孵育过夜。以TBST洗膜3次后, 加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗, 室温下在摇床上孵育1 h。再以TBST洗膜3次后, 用ECL发光剂显影。应用Image J软件分析条带灰度值, 结果以TfR1/β-actin和IRP1/β-actin的比值表示。实验重复3次。

应用GraphPad Prism 5.0软件进行统计学处理, 结果以x±s表示, 两组间比较采用t检验。

结果表明, PMA组细胞TfR1和IRP1蛋白的表达水平均明显低于对照组, 差异均有统计学意义(t=3.002、2.654, P＜0.05)。见表 1。

表1(Table 1)

表 1 PMA对MO3.13细胞铁相关蛋白表达影响(x±s)

表 1 PMA对MO3.13细胞铁相关蛋白表达影响(x±s) 组别 TfR1(n=5) IRP1(n=7) 对照组 1.164 7±0.248 5 0.890 0±0.192 5 PMA组 0.584 2±0.296 4 0.598 1±0.188 4

铁是生物体正常代谢所必需的微量元素, 对大脑的发育至关重要^{[2, 13]}。不同的神经胶质细胞由不同的铁相关蛋白来调节细胞对铁的摄取。在人类中, 无论是未分化的还是分化的少突胶质细胞, 铁的转入都是通过TfR1介导转铁蛋白(Tf)或铁蛋白的摄取^[14-15]。TfR1也被称为CD71, 是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白, 在细胞表面上广泛表达, 是介导细胞内铁摄取的主要受体^[16]。有研究表明, TfR1是细胞铁稳态的关键调节剂, 是参与铁吸收和细胞生长调节的必需蛋白质^[17-18]。IRPs是铁代谢相关蛋白转录后调节的最重要的因素^[19]。在铁缺乏期间, IRP1通过与铁反应元件(IRE)的一小部分mRNA转录物结合来提高铁水平, 从而调节其翻译并维持体内铁的稳态^[20]。IRP1与IRE结合可以抑制mRNA的翻译或增加mRNA的稳定性。当前的研究发现, IRE结构存在于TfR1 mRNA的3′非翻译区。当IRP1与IRE结合时, TfR 1mRNA的稳定性将得到提高, 进而增加TfR1的表达^[21]。本实验结果表明, PMA可同时降低分化的少突胶质细胞IRP1与TfR1的蛋白表达。推测PMA首先通过降低细胞IRP1的表达, 进而使IRP1与TfR 1mRNA的3′非翻译区的IRE结合率降低, 从而降低细胞TfR1的表达, 但其机制还有待进一步研究。

少突胶质细胞的发育和成熟需要一系列相互作用来调控OPCs的增殖和分化以及髓鞘的形成, 而铁在这一过程中起到了决定性的作用^[22]。少突胶质细胞需要铁参与髓鞘生成和作为酶的辅酶因子^[23]。有研究表明, 铁缺乏会对细胞周期起抑制作用, 但当铁浓度超过一定的阈值后, 增殖就会停止, 分化就开始了。当增殖的OPCs暴露于高水平的铁时, 细胞停止分裂并进行分化^[24]。TfR1是少突胶质细胞中唯一调控铁转入的蛋白, 本实验结果显示, 用PMA对未分化的MO3.13细胞进行分化后, TfR1和IRP1的表达显著降低。分化的MO3.13少突胶质细胞的TfR1表达降低, 表明分化的少突胶质细胞铁转入能力降低。故本文结果表明, 未分化的MO3.13少突胶质细胞对铁的吸收能力大于分化的MO3.13少突胶质细胞, 分化后的少突胶质细胞对铁的需求减少, 不会再摄取更多的铁。本实验结果为PD的治疗提供了新的思路和靶点。