2019, Vol. 55
2. 青岛市市立医院产三科, 山东 青岛 266071;
3. 青岛市第三人民医院呼吸科, 山东 青岛 266071
肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，同时也是全球恶性肿瘤死亡的主要原因[1-2]，其中非小细胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌的80%以上[3]。NSCLC目前的主要治疗方法是手术、放疗和化疗，尽管放疗和化疗的应用使NSCLC预后得到很大改善，但其生存率还是很低[4]，所以NSCLC的靶向研究显得尤为重要。近年来研究结果发现，miRNA对肺癌的进展、诊断以及治疗起着关键作用，其在肺癌的治疗研究中备受关注[5]。miRNA是一类长约20个氨基酸的小RNA，它可以与特定的靶点结合，影响靶位点的mRNA翻译，进而影响相关蛋白的表达[6]。有研究表明，miRNA-375(miR-375)与肿瘤的侵袭、转移和凋亡有着密切的联系，而且miR-375的表达与癌症病人的总生存率相关，所以推测miR-375可能是一种有用的临床预后生物标志物[7-8]。JUNG等[9]研究发现，MYC可以受miR-375的调节进而影响肿瘤的进展和表型。MYC家族包括C-MYC、N-MYC和L-MYC，对肿瘤细胞的侵袭、迁移都有很重要的作用[10-11]。已有研究表明，一些药物可以通过抑制MYC通路的激活来抑制人宫颈癌细胞的增殖、迁移和上皮间质转化(EMT)[12]；hsa-miR-24则可以通过调节c-MYC/EMT轴来抑制鼻咽癌细胞的转移能力[13]；MYC还可以通过抑制RPS19/EMT信号传导的激活来抑制癌细胞的转移[14]。本研究旨在探讨miR-375是否可通过MYC/EMT对NSCLC的侵袭和迁移产生影响。
1 材料与方法 1.1 细胞与样本所用NSCLC细胞(A549)和正常肺组织细胞(BEAS-2B)由青岛大学博雅楼实验室冻存。A549细胞用RPMI-1640(HyClone，美国)培养液培养，BEAS-2B细胞用LHC-9(HyClone，美国)培养液培养，培养细胞时两种培养液都加入体积分数0.10胎牛血清(索莱宝，北京)。含EDTA的胰蛋白酶(索莱宝，北京)用于消化贴壁细胞。NSCLC组织和癌旁组织的新鲜样本各30例，来自青岛市市立医院。本研究的组织来源病人均签署了书面同意书，研究获青岛大学附属医院伦理委员会批准。
1.2 细胞转染将A549细胞接种于96孔板中，每孔10 000个，置于含体积分数0.05 CO2的37 ℃培养箱中培养24 h。实验共分3组，在96孔板中未做任何处理的A549细胞作为空白组，将转染含空载体慢病毒(吉凯基因公司，上海)的A549细胞作为对照组，将转染表达miR-375慢病毒(吉凯基因公司，上海)的A549细胞作为实验组。将3组细胞置于培养箱继续培养10 h后，移除96孔板中的培养液，更换新的培养液，每孔100 μL。然后继续培养72 h，应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测3组细胞中miR-375的表达量。
1.3 qRT-PCR收集长势良好的细胞，按照iso plus RNA提取试剂盒(Takara，日本)的说明书提取3组细胞的总RNA，用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(Takara，日本)将RNA反转成cDNA，使用SYBR Premix Ex Taq RR420A(Takara，日本)进行qRT-PCR，检测细胞中miR-375的表达。反应条件：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40个循环；60 ℃、15 s。实验所用引物均购自上海生工，其中U6作为miRNA-375的内源性参照。引物序列见表 1。
| 表 1 qRT-PCR引物序列 |
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① 迁移实验：向24孔板(康宁，美国)的3个孔中加入含体积分数0.15胎牛血清的培养液，每孔500 μL，将3个Transwell小室(康宁，美国)分别放入3个孔中。取3组细胞各5×104个分别接种于以上3个Transwell小室内，置于细胞培养箱中培养24 h后取出，用棉签擦拭3个Transwell小室的内膜，之后小室用甲醇溶液固定10 min，用甲紫染色10 min，PBS洗3次，拍照，在显微镜下计数细胞。②侵袭实验：将基质胶(康宁，美国)与完全培养液按1:9的比例稀释，将稀释后的混合液按每孔100 μL加入Transwell小室中，置于37 ℃培养箱中4 h，其余实验步骤同迁移实验。
1.5 Western blot检测取3组细胞，用PBS洗2次后加入1 mL的PBS，使用细胞刮刀将细胞刮下分别放入3个离心管中，以5 000 r/min离心5 min。去上清留细胞沉淀，在细胞沉淀中加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，冰上裂解30 min，以12 000 r/min离心10 min，上清即为总蛋白。将提取的蛋白质加入上样缓冲液SDS-Loading Buffer，沸水浴煮5 min。取45 μg蛋白置SDS-PAGE凝胶中电泳，电泳结束后将胶中的蛋白条带转移到PVDF膜上(Millipore，美国)。用脱脂奶粉封闭2 h，在4 ℃下与MYC(1:1 000，CST)、β-actin(1:3 000，Bioss)、E-钙黏蛋白(E-cadherin，1:1 000，CST)、波形蛋白(Vimentin，1:1 000，CST)的一抗一起孵育过夜；加入二抗(1:1 000，Abcam)低速振荡60 min。用超敏型化学发光底物试剂(ECL)进行蛋白条带成像，分析条带灰度值，计算各蛋白相对表达量。
1.6 统计学方法采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计量资料结果以x±s形式表示，两组间比较采用配对t检验，多组间比较采用方差分析。以P＜0.05表示差异有显著性。
2 结果 2.1 miR-375的表达 2.1.1 NSCLC组织和癌旁组织miR-375表达的比较癌旁组织和NSCLC组织miR-375的相对表达量分别为0.40±0.20和1.00±0.03，NSCLC组织miR-375的表达明显高于癌旁组织，差异有显著性(t=16.88，P＜0.05)。
2.1.2 BEAS-2B细胞和A549细胞miR-375表达的比较BEAS-2B细胞和A549细胞miR-375的相对表达量分别为1.00±0.02和2.20±0.30，A549细胞miR-375的表达明显高于BEAS-2B细胞，差异有统计学意义(t=8.51，P＜0.05)。
2.1.3 各组细胞miR-375表达的比较实验组细胞miR-375的表达较空白组和对照组明显增加，差异有显著性(F=1 677.95，P＜0.05)，而空白组和对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表 2。
| 表 2 miR-375对NSCLC细胞miR-375表达及侵袭和迁移能力的影响(n=3, x±s) |
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与空白组和对照组相比，实验组细胞的迁移、侵袭能力均增强，差异有显著意义(F=90.21、29.55，P＜0.05)，而空白组和对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表 2。
2.3 miR-375对MYC蛋白表达的影响与空白组和对照组相比，实验组细胞MYC的表达增加，差异有显著意义(F=37.15，P＜0.05)，而空白组和对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表 3。
| 表 3 miR-375对MYC蛋白和EMT相关蛋白表达的影响(n=3, x±s) |
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与空白组和对照组相比，实验组细胞E-cadhe-rin的表达降低，Vimentin的表达升高，差异均有显著性(F=47.25、77.64，P＜0.05)，而空白组和对照组E-cadherin和Vimentin的表达比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见图 1和表 3。
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| 图 1 各组细胞MYC蛋白以及EMT相关蛋白表达的Western blot检测 |
肺癌是全球范围内很常见的一种肿瘤，NSCLC在所有肺癌类型中发病率最高[15]。NSCLC确诊时多数已发生侵袭转移，这是其死亡率高的主要原因，所以研究影响NSCLC侵袭和转移的靶点显得尤为重要。miRNAs是小分子内源性非编码RNA，可以影响基因表达的转录后调控，从而起到肿瘤抑制基因或致癌基因的作用[16-17]。已有大量的证据表明，miRNAs对NSCLC的进展有影响[18-19]。在众多的miRNAs中，越来越多的研究集中在miR-375上，miR-375与癌症总体生存率显著相关，并且对多种癌症的侵袭、转移、生长和分化产生作用[8, 20]。但miR-375在NSCLC中的研究较少，它对NSCLC的影响还不甚明确，所以本研究选择了miR-375作为NSCLC的研究靶点。
本研究结果显示，miR-375在NSCLC组织中呈高表达，与相关研究结果一致[21]，推测miR-375在NSCLC中起促癌基因的作用。进一步的实验结果显示，过表达miR-375后细胞的侵袭和迁移能力增强，表明miR-375可以调节NSCLC的侵袭迁移能力，并且是起促癌基因的作用。但是也有研究结果显示，miR-375在肺癌、食管癌、肝细胞癌中呈低表达[22-24]。目前miR-375在癌症中具体的作用还不确定，其是否能作为癌症治疗的靶点还有待进一步证实。目前，综合本实验结果和相关文献可以看出，miR-375既可以为癌基因，也可以为抑癌基因，它在不同肿瘤中的作用不同。MYC癌蛋白为“超级转录因子”，可以调控基因组15%左右的转录，其下游效应子可以参与核糖体生物合成、蛋白质翻译、协调细胞增殖和分化等生物功能[25-26]。本文实验结果显示，过表达miR-375后NSCLC细胞MYC蛋白的表达水平升高，表明miR-375可以通过调节MYC的表达来影响NSCLC的侵袭和迁移。EMT是一个动态变化的过程，在该过程中稳定的上皮细胞转化为不稳定的、具有转移和侵袭能力的间质细胞，故EMT在肿瘤的发生发展中扮演着不可或缺的角色[27-28]。MYC也可以通过调节EMT的发生发展来影响肿瘤进展[29]。本实验结果表明，随着miR-375的过表达，NSCLC细胞的MYC表达显著增加，侵袭和迁移能力显著增强，EMT相关蛋白的表达也发生明显变化，提示miR-375可以通过MYC/EMT影响NSCLC细胞的侵袭和迁移能力。
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