2019, Vol. 55
2. 河南大学淮河医院检验科, 河南 开封 475001
骨肉瘤是一种好发于青壮年和青少年的恶性骨肿瘤[1]，其恶性表型如增殖、凋亡、侵袭等与细胞内异常表达基因有关[2]。上调基因11(URG11)是近年来发现的参与细胞运动、增殖等过程的基因[3]，且在胃癌、肝癌等中发挥癌基因作用，下调URG11肿瘤生长和转移能力减弱[4-5]。URG11在骨肉瘤组织中呈阳性表达，且与肿瘤病人分期、转移相关，但其在骨肉瘤细胞中的作用尚不明确[6]。本实验通过干扰URG11的表达，探讨URG11对骨肉瘤细胞恶性表型的影响，为靶向URG11治疗骨肉瘤提供依据。
1 材料与方法 1.1 细胞和试剂骨肉瘤细胞MG63购自上海研谨生物科技有限公司；polybrene购自美国Sigma公司；SYBR定量PCR试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；阴性对照慢病毒和URG11短发夹RNA(shRNA)重组慢病毒由吉满生物科技(上海)有限公司构建；基质金属蛋白酶2(MMP-2)抗体、URG11抗体购自美国Abcam；裂解的半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved Caspase-3)抗体、基质金属蛋白酶9(MMP-9)抗体、E-钙黏蛋白(E-cadherin)抗体、裂解的半胱氨酸蛋白酶-9(Cleaved Caspase-9)抗体、波形蛋白(Vimentin)抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology。
1.2 慢病毒感染骨肉瘤细胞以每孔5×104个接种6孔板，于培养箱内培养，细胞融合度为40%时，以MOI=20分别添加慢病毒，再加入适量的polybrene(终浓度为5 mg/L)；培养12 h以后，加入新鲜培养液；培养72 h后荧光显微镜下观察荧光表达情况，以1 mg/L的嘌呤霉素筛选稳定转染的细胞系。把不感染慢病毒的细胞设置为Control组(A组)，把感染阴性对照慢病毒以及URG11 shRNA重组慢病毒的细胞分别设置为shRNA-NC(B组)、URG11 shRNA(C组)。
1.3 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定干扰效果A、B、C组细胞提取总RNA，反转录成cDNA后进行qRT-PCR。所用引物种类及其序列见表 1。用SYBR定量PCR试剂盒分析URG11表达变化，计算方法为2－△△CT法，内参为β-actin。每组实验重复3次，每次设3个复孔。
| 表 1 所用引物种类及其序列 |
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A、B、C组细胞分别用PBS洗涤2次，再加入含有PMSF的RIPA裂解溶液，于冰上孵育30 min。以BCA法测定蛋白样品浓度，每孔30 μg蛋白样品，设置120 V的电压电泳2 h后，从玻璃板中间取出凝胶。将PVDF膜置于甲醇中孵育10 s以后进行转膜，转膜置于4 ℃条件进行。将PVDF膜置于新配置的含体积分数0.05牛血清蛋白溶液中，在室温结合2 h。把URG11一抗按1:800倍稀释，PVDF膜置于一抗反应液中孵育过夜。再将二抗按1:2 000倍稀释后，把PVDF膜置于二抗反应液内孵育2 h。使用ECL发光。采用Image J分析内参β-actin和目的条带URG11的灰度值，URG11蛋白水平=URG11的灰度值/β-actin的灰度值。每组实验重复3次，每次设3个复孔。
1.5 四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞增殖A、B、C组细胞培养24 h，添加20 μL的MTT溶液和180 μL细胞培养液至每个孔内培养4 h，再加入150 μL的二甲基亚砜，混合反应后，经空白孔调零。以酶标仪检测570 nm波长处的吸光度(A)值，把Control细胞的存活率设置为100%，分析其他各组细胞存活率变化。每组实验重复3次，每次设3个复孔。
1.6 流式细胞术检测细胞凋亡A、B、C组细胞中分别添加500 μL的Binding Buffer，混合后再添加PI和Annexin V-FITC染液孵育15 min，置于流式细胞仪中检测细胞凋亡变化。每组实验重复3次，每次设3个复孔。
1.7 Transwell小室检测细胞侵袭和迁移A、B、C组细胞以不含血清的培养液悬浮，细胞密度调整为7×107/L，分别添加到Transwell小室的上室内进行迁移实验。每组添加200 μL细胞悬液，下室内添加500 μL的含血清培养液。24 h后，将小室取出，把没有穿膜的细胞擦掉并以PBS洗涤后，分别添加多聚甲醛溶液固定30 min，添加甲紫染色后，在光镜下选取5个视野，计数细胞迁移数目。在侵袭实验前以基质胶将Transwell小室湿化，其余步骤同迁移实验。每组实验重复3次，每次设3个复孔。
1.8 Western blot检测细胞中相关蛋白表达变化A、B、C组细胞按照1.4中Western blot方法检测Cleaved Caspase-3、MMP-9、Cleaved Caspase-9、E-cadherin、MMP-2和Vimentin蛋白表达变化。每组实验重复3次，每次设3个复孔。
1.9 统计分析采用SPSS 21.0软件分析实验数据，计量资料数据用 x±s表示，多组差异比较用单因素方差分析，组间比较用SNK-q检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 URG11 shRNA下调对骨肉瘤细胞中URG11表达水平影响URG11 shRNA慢病毒感染后骨肉瘤细胞中URG11 mRNA和蛋白表达水平明显下降，差异有显著性(F=181.200、97.307，P < 0.001)。URG11 shRNA可下调骨肉瘤细胞中URG11表达和转录。见图 1和表 2。
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| A：Control组，B：shRNA-NC组，C：URG11 shRNA组。 图 1 Western blot检测URG11 shRNA对骨肉瘤细胞中URG11表达影响 |
| 表 2 URG11 shRNA对骨肉瘤细胞中URG11表达和转录影响(n=9, x±s) |
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URG11 shRNA慢病毒感染后骨肉瘤细胞存活率降低、凋亡率升高，差异有显著意义(F=28.897、625.516，P < 0.05)。下调URG11可抑制骨肉瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡。见图 2和表 3。
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| A：Control组，B：shRNA-NC组，C：URG11 shRNA组。 图 2 流式细胞术检测URG11 shRNA对骨肉瘤细胞凋亡影响 |
| 表 3 URG11 shRNA对骨肉瘤细胞存活率和凋亡率影响(n=9, χ/%, x±s) |
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URG11 shRNA慢病毒感染后骨肉瘤细胞侵袭和迁移数目降低，差异有统计学意义(F=93.373、101.207，P < 0.001)。下调URG11可抑制骨肉瘤细胞侵袭和迁移。见表 4。
| 表 4 URG11 shRNA对骨肉瘤细胞侵袭和迁移影响(n=9, x±s) |
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URG11 shRNA慢病毒感染后，骨肉瘤细胞中凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9表达水平升高，侵袭和迁移蛋白MMP-2、MMP-9表达水平降低，间质细胞标志物Vimentin蛋白表达水平下降，上皮细胞标志物E-cadherin蛋白表达水平升高，差异均具有统计学意义(F=28.064~148.737，P < 0.01)。下调URG11则能够抑制骨肉瘤细胞中MMP-2、MMP-9蛋白表达，促进Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表达，并且对细胞上皮间质转化(EMT)具有抑制作用。见图 3和表 5。
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| A：Control组，B：shRNA-NC组，C：URG11 shRNA组。 图 3 Western blot检测URG11 shRNA对骨肉瘤细胞中相关蛋白表达影响 |
| 表 5 URG11 shRNA对骨肉瘤细胞中相关蛋白表达影响(n=9, x±s) |
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URG11是被HBx蛋白上调的基因，与肿瘤的发生、发展和转移密切相关[7-8]。有报道显示，在胃癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌等肿瘤中URG11高表达，下调URG11表达后肿瘤细胞生长、侵袭能力减弱，说明URG11可能在肿瘤中充当癌基因[4, 9-11]。研究显示，URG11高表达于骨肉瘤组织，且与骨肉瘤病人存活时间、转移等有关[6]。本文结果表明，下调URG11后的骨肉瘤细胞的增殖能力和侵袭迁移能力降低，细胞凋亡率升高，说明下调URG11可以抑制骨肉瘤细胞的恶性表型，其作用与之前在其他肿瘤中研究报道一致。
细胞凋亡受多种因素共同调控，其中Caspase蛋白家族是目前研究较为透彻的凋亡蛋白[12]。位于Caspase凋亡反应上游的蛋白成员如Caspase-9激活后可以促进凋亡反应的发生，而位于凋亡反应下游的Caspase-3激活后诱导细胞凋亡[13-14]。而且二者只有被激活后形成Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9才可发挥促细胞凋亡功能[15-16]。文献报道，虫草素可通过上调Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白的表达诱导细胞凋亡，从而发挥抗骨肉瘤的作用[17]；雷公藤红素也提高了骨肉瘤细胞HOS中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9的表达而使细胞凋亡[18]。本文结果显示，下调URG11表达后的骨肉瘤细胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表达水平升高，这说明下调URG11可能激活Caspase凋亡反应，这与细胞凋亡检测结果一致，进一步证实了下调URG11具有诱导骨肉瘤细胞凋亡的作用。
骨肉瘤具有较高的侵袭和转移性[19]；而EMT与侵袭和迁移相关，且EMT的肿瘤细胞转移能力更强[20]。E-cadherin和Vimentin是细胞EMT的标志[21-23]。骨肉瘤组织中E-cadherin呈低表达，而Vimentin高表达[24]。研究也显示，沉默Vimentin能够抑制肝癌细胞的迁移和侵袭[25]。本实验结果显示，下调URG11后的骨肉瘤细胞中E-cadherin水平升高，Vimentin水平降低，说明下调URG11可以抑制骨肉瘤细胞EMT。
此外，基质金属蛋白酶也与细胞转移相关，其可通过降解细胞外基质促进细胞转移[26]。MMP-9和MMP-2是基质金属蛋白酶的成员[27-28]。FOXF1-AS1通过MMP-2/-9途径促进骨肉瘤细胞的迁移和侵袭[29]；下调MMP-9表达可抑制人骨肉瘤细胞转移[30]。本文的实验结果显示，下调URG11后的骨肉瘤细胞中MMP-2和MMP-9表达水平均下降，说明下调URG11可以抑制骨肉瘤细胞迁移和侵袭，URG11具有抗骨肉瘤细胞转移潜能。
总之，本文结果证实了下调URG11具有抗骨肉瘤细胞增殖、侵袭、迁移、EMT和诱导凋亡的作用，URG11表达可能是靶向治疗骨肉瘤的潜在靶点。本文结果为研究URG11在肿瘤中的作用提供了参考。本次实验研究没有在体内和多株骨肉瘤细胞中进行验证，后续会对上述部分内容及其具体的调控网络进行探索。
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