2019, Vol. 55
视网膜母细胞瘤是一种较为常见的恶性肿瘤，多发生于视网膜核层，具有一定的家族倾向，常发生于5岁以下的小儿，且容易发生颅内和远处转移，严重威胁病儿的生命健康[1-2]。探讨视网膜母细胞瘤发病的分子机制并寻找早期诊断的生物学标志物和新的治疗靶点，对于提高视网膜母细胞瘤的诊治水平和改善病儿预后具有重要意义[3-4]。已有研究表明，视网膜母细胞瘤的发生和发展与基因突变、表观遗传修饰等多种分子机制有关，而视网膜母细胞瘤蛋白(Rb1蛋白)可能在这一过程中发挥着极其重要的作用[5-6]。Rb1是一种抑癌蛋白，在肺癌、胃癌、乳癌等多种癌症中存在失活情况; 而microRNA-215(miRNA-215)在多种肿瘤组织中均异常表达，其在肿瘤增殖、迁移及侵袭等多种病理过程中均发挥着重要功能[8-9]，但其能否抑制Rb1蛋白的表达目前尚不明确。本研究探讨视网膜母细胞瘤组织miRNA-215的表达特点及其与Rb1蛋白水平及临床病理学特征的相关性，现将结果报告如下。
1 资料与方法 1.1 一般资料2011年1月—2014年12月，选取在我院眼科行手术摘除眼球治疗并经病理诊断为视网膜母细胞瘤病人65例(73眼)，男25例，女40例; 年龄5.0个月~8.5岁，平均(3.9±0.9)岁; 分化型25眼，未分化型48眼; 发生神经浸润38眼，未发生神经浸润35眼; 出现淋巴结转移29例，未出现淋巴结转移36例。所有病儿术前均未接受化疗及局部放疗等治疗。本研究获得病人监护人知情同意及医院的伦理学审核通过。
1.2 检测指标及方法 1.2.1 RT-PCR检测miRNA-215表达取病人手术切除的肿瘤组织及癌旁正常组织各50 mg，应用Trizol提取组织和细胞中总RNA，利用逆转录试剂盒逆转录为DNA，在聚合酶的作用下进行扩增，引物及其序列见表 1。
| 表 1 PCR引物及其序列 |
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取扩增后的产物，利用荧光定量PCR仪(AB 7500cx)定量检测miRNA-215水平。Trizol提取试剂盒、逆转录试剂盒和荧光定量试剂盒均购自美国AB公司，具体检测步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。
1.2.2 Western blot检测Rb1蛋白表达取手术切除的肿瘤组织及癌旁正常组织各75 μg，以100 g/L十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，分离后转移至孔径为0.45 μm的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，置于50 g/L脱脂奶粉中封闭2 h; 加入一抗(1:1 000稀释的Rb1多克隆抗体)后4 ℃孵育过夜，以体积分数0.005的TBS-T溶液洗膜3次后再加入HRP标记的二抗(1:10 000)进行反应，以体积分数0.005的TBS-T溶液洗膜3次，用化学发光法进行显色，并应用图像软件进行灰度值分析，计算目标蛋白与β-actin的灰度比值。
1.2.3 miRNA-215蛋白检测培养视网膜母细胞瘤Y79细胞，稳定传代2~3代后，取对数生长期的细胞，将miRNA-215表达质粒(miRNA-215 mimics)、miRNA-215抑制质粒(miRNA-215 inhibitor)及其相应的miRNA-215对照质粒转染视网膜母细胞瘤系细胞，用培养基制备单细胞悬液，转染24、48、72 h后每孔加5 g/L的MTT溶液20 μL; 孵育4 h后，吸出培养液，每孔加DMSO溶液150 μL，静置15 min后以酶标仪检测490 nm波长处各孔的吸光度值，以其表示miRNA-215蛋白值。
1.2.4 BrdU检测取对数生长期细胞制成单细胞悬液接种于96孔板，转染后培养24 h，加入20 μL BrdU标记液继续培养6 h。先加入Fix Denat使DNA变性，再加入100 μL HRP标记的抗BrdU抗体，洗涤3次后加入100 μL的TMB底物液进行显色，20 min后加1 mol/L H2SO4Y终止反应，在酶标仪上检测吸光度值，此吸光度值即BrdU值[10]。
1.2.5 Caspase-3蛋白检测将转染48 h后的细胞加2.5 g/L胰酶进行消化，1 000 r/min离心5 min后弃掉胰酶，以PBS洗涤细胞2次，再以2 000 r/min离心5 min后收集细胞沉淀; 加入50 μL预冷的Lysis Buffer并置于冰上裂解20~30 min，随后于4 ℃以10 000 r/min离心1 min。吸取上清液，应用BCA法测定Caspase-3蛋白浓度，检测步骤严格按照Caspase-3活性检测试剂盒(北京中杉金桥生物科技有限公司)说明书进行操作。
1.2.6 细胞凋亡率检测取转染48 h后的细胞，以PBS洗涤后1 000 r/min离心5 min，弃去上清，以Binding buffer重悬细胞并调整密度为1×109/L，用流式细胞仪进行细胞凋亡率检测[11]。
上述每项实验均重复12次。
1.3 统计学方法使用SPSS 16.0和GraphPadPrism 5统计软件进行统计学分析。两组间计数资料比较采用χ2检验; 计量资料以x±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 临床病理特征对miRNA-215及Rb1蛋白表达影响视网膜母细胞瘤肿瘤组织miRNA-215表达显著高于癌旁组织，Rb1蛋白表达显著低于癌旁组织，差异有显著性(t=14.14、92.80，P＜0.01)。分化型肿瘤组织miRNA-215表达低于未分化型，而Rb1蛋白表达高于未分化型(t=－55.30、63.24，P＜0.01);有神经浸润和淋巴结转移病人肿瘤组织中miRNA-215表达高于无神经浸润和淋巴结转移者(t=－2.79、－76.18，P＜0.01)，Rb1蛋白表达低于未出现神经浸润和淋巴结转移者(t=344.30、80.56, P＜0.01)。见表 2。
| 表 2 miRNA-215、Rb1蛋白表达与视网膜细胞瘤临床病理特征关系(x±s) |
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miRNA-215类似物显著上调miRNA-215表达水平，增强细胞增殖能力，降低细胞内Caspase-3活性，减少Y79细胞凋亡百分比; miRNA-215抑制物显著降低miRNA-215表达水平，减弱细胞增殖能力，提高细胞内Caspase-3活性，增加细胞凋亡百分比，差异均有统计学意义(F=148.5~3 938.0，P＜0.01)。见表 2。
| 表 2 miRNA-215类似物和抑制物对视网膜母细胞瘤Y79细胞各指标的影响(n=12, x±s) |
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视网膜母细胞瘤是一种来源于光感受器前体细胞的恶性肿瘤，也是婴幼儿眼病中性质最严重、危害性最大的一种恶性肿瘤[12-13]。视网膜母细胞瘤常见于3岁以下儿童，具有家族遗传倾向，可单眼、双眼先后或同时罹患，易发生颅内及远处转移，常常危及病儿生命[14-16]。视网膜母细胞瘤的临床表现复杂，可表现为结膜内充血水肿、角膜水肿、虹膜新生血管、玻璃体混浊、眼压升高及斜视等[17-18]。视网膜母细胞瘤的确切病因和具体发病机制目前尚不完全清楚，一般认为与遗传和病毒感染等因素有关，而位于13q14抑癌基因Rb1突变、失活可能是导致视网膜母细胞瘤发生的主要机制[19]。视网膜母细胞瘤的危害较为严重，如何早期诊断及治疗是提高治疗效果、降低死亡率的关键[20]。MicroRNA(miRNA)是一类重要的内源性单链非编码小RNA分子，可调控细胞的发育、增殖、分化、代谢、凋亡和应激等过程[21-22]。越来越多的研究表明，miRNA与肿瘤的发生、发展等过程有着密切的关系，其中miRNA-215在多种肿瘤组织中均发挥着癌基因或抑癌基因的作用[23]。也有研究表明，miRNA-215在胃癌组织中高表达，并与肿瘤细胞的侵袭和转移能力明显相关[24]，但目前对于miRNA-215与视网膜母细胞瘤发生和发展关系的研究却较少。
研究表明，miRNAs表达或功能异常与肿瘤的发生和发展有着密切的关系[25-26]。Rb1蛋白是一种肿瘤抑制蛋白，也是细胞周期调控蛋白，可以通过抑制细胞周期进程防止细胞过度生长直至其具备分裂条件，其与肿瘤的发生和发展有着密切的关系[27]。本文研究显示，miRNA-215在视网膜母细胞瘤组织中的表达显著高于癌旁组织，而Rb1蛋白的表达水平显著低于癌旁组织，且分化型组织miRNA-215表达高于未分化型，Rb1蛋白表达则低于未分化型，提示miRNA-215、Rb1在视网膜母细胞瘤的发生、发展过程中起癌基因作用，且miRNA-215相对表达量越高，Rb1蛋白相对表达量越低，肿瘤的分化程度越高。进一步分析显示，有神经浸润和淋巴结转移的视网膜母细胞瘤病人肿瘤组织中miRNA-215蛋白表达高于未出现神经浸润和淋巴结转移者，而Rb1蛋白低于未出现神经浸润和淋巴结转移者，提示miRNA-215、Rb1蛋白有可能成为视网膜母细胞瘤预后的监测指标。
肿瘤细胞的活力和增殖能力增强以及凋亡的减弱是其重要的生物学特征，也是肿瘤发生发展的重要生物学基础[28-29]。本文结果显示，上调miRNA-215蛋白表达水平后细胞的增殖能力明显增强，而Y79细胞内Caspase-3表达降低，凋亡细胞明显减少; 而下调miRNA-215表达水平可明显减弱细胞增殖能力，提高细胞内Caspase-3活性，增加细胞凋亡百分比，提示miRNA-215的表达与视网膜母细胞瘤细胞的增殖能力、细胞活性以及凋亡有着密切的关系，其高表达可通过促进肿瘤细胞增殖、增强细胞活性、减少细胞凋亡，促进视网膜母细胞瘤的发生和发展[30-31]。
本文研究结果还表明，miRNA-215抑制物能显著提高Y79细胞内Rb1蛋白的表达，而miRNA-215类似物能显著降低Y79细胞内Rb1蛋白的表达，提示miRNA-215高表达可以显著抑制Y79细胞内Rb1蛋白的表达，而下调miRNA-215表达可以显著提高Y79细胞内Rb1蛋白的表达，这可能是miRNA-215参与视网膜母细胞瘤的发生和发展过程的主要机制，但其具体作用机制仍需做进一步的深入研究。
综上所述，miRNA-215在视网膜母细胞瘤的发生、发展过程中发挥癌基因作用，其通过调控Rb1蛋白的表达影响视网膜母细胞瘤的发生以及发展，miRNA-215有可能成为视网膜母细胞瘤预后的监测指标。
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