视网膜母细胞瘤是一种较为常见的恶性肿瘤, 常发生于5岁以下婴幼儿, 具有一定的家族倾向, 且容易发生颅内和远处转移, 严重威胁病儿的生命健康^[1-4]。目前, 视网膜母细胞瘤发病机制仍不完全清楚, 一般认为与基因突变、表观遗传修饰等多种分子机制有关^[6-7]。研究表明, 细胞癌变与细胞周期调控异常密切相关, 细胞周期调节蛋白(Cyclin D1)及视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)等均参与了细胞周期G₁/S期的转换, 与肿瘤的发生发展密切相关^[8-9], 但目前对于Cyclin D1和pRb与视网膜母细胞瘤发病相关性及作用机制的研究较少。本研究对视网膜母细胞瘤病人癌组织及其配对的癌旁正常组织的Cyclin D和pRb表达水平进行检测, 并分析两种蛋白表达与病人临床病理特征及预后的关系, 旨在为视网膜母细胞瘤诊治和预后判断提供依据。

1 资料与方法 1.1 一般资料

2010年9月—2015年1月, 选取我院眼科收治、经病理诊断为视网膜母细胞瘤并行手术摘除眼球病人62例(70眼), 男23例(26眼), 女39例(44眼); 病人年龄4个月~9.5岁, 平均(4.1±0.8)岁; 分化型25眼, 未分化型45眼; 发生神经浸润36眼, 未发生神经浸润34眼; 出现淋巴结转移30眼, 无淋巴结转移40眼。所有病儿术前均未接受化疗及局部放疗等治疗。收集70眼手术摘除眼球标本癌组织和癌旁组织(距癌灶边缘5 cm)。本研究获得所有病儿监护人知情同意及医院的伦理学审核。

1.2 Western blot方法检测Cyclin D1及pRb水平

取癌组织及其配对的癌旁正常组织制备蛋白样本, 以100 g/L十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶进行电泳, 分离后转移至孔径为0.45 μm的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜, 置于50 g/L脱脂奶粉中封闭2 h; 加入一抗Cyclin D1兔抗人单克隆抗体和pRb兔抗人单克隆抗体(美国abcam公司), 4 ℃孵育过夜; 以5 g/L TBS-T溶液洗膜3次后加入HRP标记的二抗进行反应; 以5 g/L TBS-T溶液洗膜3次, 用化学发光法进行显色, 并采用Quantity One软件(BIO-RAD公司)进行灰度值分析, 计算各目标蛋白与β-actin的灰度比值。

1.3 免疫组化方法检测Cyclin D1及pRb表达

取癌组织及其配对的癌旁正常组织常规石蜡包埋, 厚度4 μm连续切片, 常规脱蜡至水, 切片浸入50 mmol/L(pH值8.0)乙二胺四乙酸溶液中, 后用微波抗原修复10 min; 冷却到室温, 充分水洗以及磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗, 并滴加正常山羊血清封闭液, 室温维持20 min; 去掉多余液体, 加入Cyclin D1和pRb多抗或单抗, 维持4 ℃过夜后PBS洗涤; 再加入SP 9000通用型生物素标记的二抗, 37 ℃维持40 min; 用二氨基联苯胺(DAB)显色30 s, 苏木精复染, 系列乙醇脱水及透明, 中性树胶封固, 显微镜下观察。每张切片选择5个具有代表性的高倍视野, 以细胞胞质或细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性细胞, 阳性细胞占计数细胞百分率> 10%为阳性表达^[10-12]。

1.4 病理特征诊断

① 分化型特点为:瘤细胞呈方形或低柱状排列, 细胞核偏心、相对较小, 胞质较多, 核分裂象少, 以蔷薇花或菊形团和小花结构为主, 围绕一个中央腔隙形成菊花形; 未分化型特点为:瘤细胞排列不规则, 细胞形态、大小不均, 胞浆少, 核大深染, 核分裂象较多, 绕血管外围的存活瘤细胞可呈珊瑚样或指套样排列(图 1A、B)。②通过眼眶MRI、颅脑MRI检查病儿是否出现视神经浸润和淋巴结转移。视神经转移表现为视神经增粗, T₂WI呈较高信号, T₁WI呈较低信号, 增强后明显强化(图 1C); 颈部淋巴结转移图像特点见图 1D。

1.5 Cyclin D1、pRb蛋白水平与生存时间的相关性

对视网膜母细胞瘤组织中Cyclin D1及pRb表达水平进行统计分析, 以高于正常组织Cyclin D1水平为Cyclin D1阳性, 低于正常组织pRb水平为pRb阴性, 分析Cyclin D1、pRb蛋白水平与生存时间的相关性。术后定期电话随访, 截至2017年6月, 统计自手术日至末次随访的时间, 生存时间以月为单位, 研究结束、其他原因死亡和失访作为截尾数据处理^[13]。

1.6 统计学方法

使用SPSS 16.0和GraphPad Prism 5软件进行统计学分析。两组计量资料结果以x±s形式表示, 组间比较采用t检验, P < 0.05表示差异有统计学意义^[14]。应用Kaplan-Meier法对视网膜母细胞瘤病人累积生存曲线进行log-rank检验。

2 结果 2.1 Cyclin D1、pRb表达及其与病人临床病理特征的相关性

视网膜母细胞瘤肿瘤组织中Cyclin D1表达水平显著高于癌旁组织(t=-15.79, P < 0.01), pRb表达水平显著低于癌旁组织(t=183.51, P < 0.01);肿瘤组织分化型Cyclin D1、pRb表达水平均高于未分化型(t=55.30、43.91, P < 0.01);伴神经浸润和淋巴结转移的肿瘤组织中Cyclin D1表达高于未出现神经浸润和淋巴结转移者(t=71.03、49.44, P < 0.01), pRb表达低于未出现神经浸润和淋巴结转移者(t=－151.80、－69.97, P < 0.01)。见图 2、表 1。

2.2 Cyclin D1及pRb表达与病人生存期关系

视网膜母细胞瘤70眼中, Cyclin D1表达阳性55眼、阴性15眼, pRb表达阳性10眼、阴性60眼。log-rank分析结果显示, Cyclin D1表达阳性的病儿累计生存率显著低于阴性病儿, pRb表达阳性病儿累计生存率显著高于阴性病儿, 差异有统计学意义(P < 0.01)。见图 3~5。

3 讨论

视网膜母细胞瘤是婴幼儿眼病中性质最严重、危害性最大的一种恶性肿瘤, 主要来源于光感受器前体细胞, 常见于3岁以下儿童^[15-17]。视网膜母细胞瘤具有一定的家族遗传倾向, 可单眼、双眼先后或同时罹患, 且易发生颅内及远处转移, 常常危及病儿生命^[18]。视网膜母细胞瘤病人的临床表现多为结膜内充血和水肿、角膜水肿、虹膜新生血管、玻璃体浑浊、眼压升高及斜视等, 但其确切的病因和具体发病机制目前尚不完全清楚^[19-20]。研究表明, 视网膜母细胞瘤可能与遗传和病毒感染等因素有关, 而原癌基因的激活、抑癌基因的失活以及转录调控可能是肿瘤发生和发展的分子机制^[21]。

Cyclin D1是一种反映细胞周期变化的蛋白, 也是细胞周期的正向调控因子, 主要负责细胞周期进展中的G₁/S转换, 一旦Cyclin D1表达异常上调, 则会导致组织细胞生长无序增加, 进而导致肿瘤的发生^[22]。近年来, Cyclin D1在肿瘤发生发展中的作用越来越受到重视, 在很多恶性肿瘤中均发现了Cyclin D1过度表达^[23-24]。有研究表明, Cyclin D1过表达与宫颈癌的发生发展以及组织学类型、分化程度等密切相关^[25]; 还有研究认为, Cyclin D1高表达在肝癌的疾病过程也发挥着重要的作用^[26]。本研究表明, Cyclin D1在视网膜母细胞瘤组织中的表达水平显著高于癌旁组织, 分化型肿瘤组织Cyclin D1表达高于未分化型, 伴随神经浸润和淋巴结转移的肿瘤组织中Cyclin D1表达高于未出现神经浸润和淋巴结转移者, 提示Cyclin D1表达在视网膜母细胞瘤的发生、发展过程中起着重要的作用, Cyclin D1相对表达量越高, 肿瘤的分化程度越高。

pRb是一种肿瘤抑制蛋白, 也是细胞周期调控蛋白, 其基因Rb位于人类染色体13q14上, 可以通过抑制细胞周期进程, 防止细胞过度生长直至其具备分裂条件, 与肿瘤细胞的增殖有密切的关系^[27]。研究表明, pRb在乳癌、鼻咽癌、结直肠癌等多种肿瘤组织中表达异常, 而其缺失和突变均可能会影响细胞增殖调控^[28]。本研究结果显示, pRb在肿瘤组织中的表达水平显著低于癌旁组织, 分化型肿瘤组织pRb表达低于未分化型, 伴随神经浸润和淋巴结转移的肿瘤组织中pRb表达低于未出现神经浸润和淋巴结转移者, 提示pRb在视网膜母细胞瘤的病理进程中起着重要的作用, 其相对表达量越低, 肿瘤的分化程度越低。

本文结果还显示, Cyclin D1表达阳性的病人累计生存率显著低于阴性病人, pRb表达阳性病人累计生存率显著低于阴性病人, Cyclin D1和pRb的表达与视网膜母细胞瘤病人预后明显相关, Cyclin D1相对表达量越高, pRb相对表达量越低, 病人的预后越差, 生存期越短。Cyclin D1和pRb表达检测可能成为视网膜母细胞瘤预后的监测指标。

综上所述, Cyclin D1、pRb在视网膜母细胞瘤的发生、发展过程中发挥重要作用, Cyclin D1、pRb有可能成为视网膜母细胞瘤预后的监测指标。