2019, Vol. 55
肾病综合征是一种发展缓慢、相对良性的疾病，但若未能及时有效诊治可导致病情进展甚至发展成为慢性肾衰竭。氧化应激是多种病理损伤的共同途径，贯穿于慢性肾脏病发生、发展的过程中。慢性肾脏病的发生、发展及恶化与体内氧化物质增多、抗氧化物质减少密切相关[1]。KURO-O等[2]研究显示，klotho主要在肾脏中高表达。MITANI等[3]采用原位杂交技术研究表明，Klotho mRNA主要在肾小管上皮细胞中表达，氧化应激和肾素-血管紧张素系统(RAS)的激活可以抑制其在肾脏中的表达。有研究结果表明，在肾小球肾炎模型小鼠体内过表达klotho蛋白，可使小鼠具有对抗氧化应激从而减少肾损伤的功能[4]。以上研究表明，klotho蛋白在体内能够抑制氧化应激，可以通过检测klotho蛋白在体内的表达水平估测小鼠肾脏的损伤情况。奥美沙坦酯为血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂，临床上常用于降低血压和减少尿蛋白。有研究表明，奥美沙坦酯通过抑制血管紧张素Ⅱ引起的氧化应激起到保护肾脏的作用[5]。他克莫司为新型免疫抑制剂，属于钙调神经蛋白酶抑制剂，可对钙离子传导通路进行干扰，特异性提高细胞内钙离子浓度，减弱细胞去磷酸化功能，对白细胞介素分泌进行控制，发挥免疫抑制作用，近年来开始应用于肾病综合征的临床治疗，具有减少尿蛋白、延缓肾脏疾病进展的作用。本研究采用单次尾静脉注射阿霉素方法建立阿霉素肾病模型，给予奥美沙坦酯及他克莫司灌胃治疗，探讨两种药物对模型大鼠肾脏氧化应激反应及klotho蛋白表达的影响，以期为他克莫司治疗肾病综合征提供新的理论支持。
1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 动物清洁级雄性Wistar大鼠60只，体质量230~260 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2016-0006，饲养于青岛大学医学院动物房。
1.1.2 主要试剂奥美沙坦酯(第一三共制药(上海)有限公司)，盐酸阿霉素(MedChemExpress)，他克莫司(Astellas Ireland Co., Ltd)，兔抗鼠anti-klotho多克隆抗体(英国Abcam)，β-actin(北京博奥森)，免疫组化试剂盒(北京中杉金桥)，DAB显色试剂盒(福州迈新)，苏木精-伊红染色试剂(北京索莱宝)，Trizol试剂(美国Invitrogen)，cDNA反转录试剂盒和RT-PCR试剂盒(北京Takara)。
1.2 实验方法 1.2.1 动物分组及处理大鼠适应性喂养1周后，随机分为正常对照组(NC组)、阿霉素肾病模型组(ADR组)、奥美沙坦酯治疗组(OLM组)以及他克莫司治疗组(FK506组)，每组15只。其中ADR组、OLM组和FK506组大鼠给予一次性尾静脉注射阿霉素5 mg/kg造模，NC组大鼠注射等量的生理盐水。7 d后留取大鼠24 h尿蛋白，与正常对照大鼠相比，尿蛋白升高有统计学意义视为造模成功[6]。造模后，OLM组连续12周给予奥美沙坦酯10 mg/(kg·d)灌胃[5]，FK506组连续12周给予他克莫司0.5 mg/(kg·d)灌胃[7]，NC组及ADR组给予等量生理盐水灌胃。
1.2.2 24 h尿蛋白检测于实验第4、8、12周末从每组中随机各选5只大鼠放入清洁代谢笼中，收集24 h尿液，－80 ℃保存，用于检测24 h尿蛋白定量。实验重复3次，取均值。
1.2.3 标本采集分别于实验第4、8、12周末每组取5只大鼠，处死，打开腹腔游离肾脏。迅速取出一侧肾脏放入40 g/L中性甲醛中固定，4 ℃保存，用于苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色；将另一侧肾组织快速放入液氮中，－80 ℃保存，用于Western blot和实时荧光定量PCR(q-PCR)。
1.2.4 肾组织病理学观察肾组织经包埋制成石蜡切片，切片脱蜡、复水后经苏木精染色10 min、伊红染色5 min，脱水、透明、封片，在显微镜下观察肾组织病理改变。
1.2.5 超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的测定采用羟胺法检测大鼠肾组织中SOD活性，采用比色法检测大鼠肾组织中MDA含量。均严格按照试剂盒说明进行操作。实验重复3次，取均值。
1.2.6 Western blot检测klotho蛋白的表达提取肾组织中总蛋白，加入RIPA裂解液匀浆后，用BCA法检测蛋白浓度，加入4×蛋白上样缓冲液，金属浴煮沸5 min，各组蛋白分别上样，用100 g/L SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜上，以体积分数0.05的牛奶封闭1 h，加入一抗klotho(1:1 000)和β-actin(1:2 000)，4 ℃孵育过夜，洗膜，加入二抗常温孵育，洗膜后显影，用Image J软件分析蛋白的相对表达量。实验重复3次，取均值。
1.2.7 q-PCR检测klotho mRNA的表达按照Triol试剂说明书提取肾组织总RNA，逆转录合成cDNA，进行q-PCR。引物由睿博兴科生物技术有限公司合成，引物序列见表 1。反应条件为：95 ℃、10 s，57 ℃、30 s，共40个循环。用2－△△Ct计算目的基因mRNA相对表达量。实验重复3次，取均值。
| 表 1 PCR检测所用引物序列 |
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应用GraphPad Prism 5.0软件进行统计学分析，所得实验数据以x±s表示，数据间比较采用析因设计的方差分析，相关性分析采用Spearson相关分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 造模后大鼠一般情况大鼠尾静脉注射阿霉素1周后均出现不同程度的腹泻，食量下降，活动减少；2周后腹泻逐渐停止，饮食及活动逐渐恢复；第3周出现轻度水肿，以足部及睾丸最明显；第4周水肿最重。
2.2 各组大鼠24 h尿蛋白定量比较大鼠24 h尿蛋白定量检测组别与时间存在交互效应(F时间×组别=101.579，P < 0.05)。ADR组、OLM组及FK506组大鼠各时间点24 h尿蛋白含量均高于NC组，OLM组和FK506组较ADR组降低，FK506组较OLM组降低，差异均有统计学意义(F=126.969~781.905，P < 0.05)；组内比较，随着时间的延长，ADR组24 h时尿蛋白含量进行性升高，OLM组和FK506组进行性降低，差异具有统计学意义(F=16.957~182.942，P < 0.05)。见表 2。
| 表 2 不同时间点各组大鼠24 h尿蛋白定量比较(n=5，m/mg，x±s) |
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与NC组相比，ADR组实验第4周末可见肾小管上皮细胞轻度萎缩，上皮细胞内有颗粒和空泡变性，近端小管上皮细胞刷状缘脱落、管腔扩大并可见蛋白管型及少量炎细胞浸润；第8周末可见肾小管上皮细胞明显萎缩，空泡及颗粒变性更加明显，管内蛋白管型较前增多，间质血管肿胀更加明显，炎细胞数量增多；第12周末可见肾小管灶状萎缩，蛋白管型更多，肾间质小动脉管壁增厚、管腔狭窄，间质内炎细胞浸润更加明显，并有轻度纤维化。OLM组和FK506组大鼠肾脏的病理表现较ADR组呈时间依赖性的减轻，且FK506组病理改变较OLM组更加明显。
2.4 各组大鼠肾组织SOD活性和MDA含量比较大鼠肾组织SOD活性检测组别与时间存在交互效应(F时间×组别= 201.531，P < 0.05)。ADR组、OLM组及FK506组大鼠各时间点肾组织中SOD活性均较NC组降低，OLM组和FK506组较ADR组升高，FK506组较OLM组升高，差异均有显著意义(F=125.782~467.589，P < 0.05)；组内比较，随着时间的延长，ADR组大鼠肾组织中SOD活性进行性降低，OLM组及FK506组进行性升高，差异具有显著性(F=6.871~57.072，P < 0.05)。见表 3。
| 表 3 不同时间点各组大鼠肾组织SOD活性的比较(n=5，z/m(kU/g)，x±s) |
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大鼠肾组织MDA含量检测组别与时间存在交互效应(F时间×组别= 67.026，P < 0.05)。ADR组、OLM组及FK506组大鼠各时间点肾组织中MDA含量均较NC组升高，OLM组及FK506组较ADR组降低，FK506组较OLM组降低，差异具有统计学意义(F=52.782~162.589，P < 0.05)；组内比较，随着时间的延长，ADR组大鼠肾组织中MDA含量进行性升高，OLM组及FK506组进行性降低，差异具有显著性(F=6.871~57.072，P < 0.05)。见表 4。
| 表 4 不同时间点各组大鼠肾组织MDA含量的比较(n=5，z/m(μmol/g)，x±s) |
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大鼠肾组织中klotho mRNA表达检测组别与时间存在交互效应(F时间×组别=326.571，P < 0.05)。ADR组、OLM组及FK506组大鼠各时间点肾组织中klotho mRNA的表达均较NC组降低，OLM组及FK506组较ADR组升高，FK506组较OLM组升高，差异具有统计学意义(F=116.671~507.513，P < 0.05)；组内比较，随着时间的延长，ADR组大鼠肾组织中klotho mRNA的表达进行性降低，OLM组和FK506组的表达进行性升高，差异具有统计学意义(F=12.982~40.485，P < 0.05)。见表 5。
| 表 5 不同时间点各组大鼠肾组织中klotho mRNA相对表达量的比较(n=5，x±s) |
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大鼠肾组织中klotho蛋白表达检测组别与时间存在交互效应(F时间×组别=223.581，P < 0.05)。ADR组、OLM组及FK506组大鼠各时间点肾组织中klotho蛋白的表达均较NC组降低，OLM组及FK506组较ADR组升高，FK506组较OLM组升高，差异具有统计学意义(F=126.969~609.513，P < 0.05)；组内比较，随着时间的延长，ADR组大鼠肾组织中klotho蛋白表达进行性降低，OLM组和FK506组进行性升高，差异具有统计学意义(F=10.985~38.405，P < 0.05)。见图 1。
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| 图 1 不同时间点各组大鼠肾组织中klotho蛋白表达的Western blot检测 |
大鼠肾组织中klotho蛋白表达与MDA含量及24 h尿蛋白定量呈负相关(r=－0.896、－0.948，P < 0.01)，与SOD活性呈正相关(r=0.927，P < 0.01)。见图 2。
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| 图 2 klotho蛋白表达与氧化应激的关系 |
阿霉素肾病模型是目前公认的肾病综合征动物模型。阿霉素对肾脏具有慢性毒性作用，它可以通过多种机制引起肾脏损伤，其中氧化应激是比较常见和重要的机制之一。有研究表明，活性氧(ROS)是引起足细胞损伤的重要因素[8]。另有研究表明，ROS可引起肾小管内皮细胞损伤，影响肾小管的重吸收作用，从而导致大量蛋白质随尿液排出体外，引起蛋白尿[9]。蛋白尿是诊断肾病综合征的标准之一，也是肾功能进展的独立危险因素。Klotho是一种与衰老相关的基因，其对机体的保护作用已经被广泛报道[10]。LIM等[11]研究表明，klotho通过抑制氧化应激、RAS激活和改善线粒体功能发挥肾脏保护作用。另有研究表明，klotho过表达转基因小鼠的锰超氧化物歧化酶(MnSOD)表达量升高[12-13]，从而起到抑制氧化应激的作用。然而有研究表明，当机体出现氧化应激时，klotho基因在肾脏的转录及表达均减少[4]。ROS的产生是阿霉素肾病模型大鼠肾脏损伤的主要原因，因此，抑制氧化应激不仅可减轻其对肾脏的损伤还可提高klotho基因在肾小管上皮细胞的表达，从而起到保护肾脏的作用。
研究表明，肾脏RAS过度激活与许多肾脏疾病有关，RAS过度激活的主要效应包括氧化应激、NF-κB激活、纤维母细胞增殖及细胞外基质过度沉积等[14]。血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)类药物具有降血压、减少尿蛋白及保护肾脏的作用，其减少尿蛋白的主要机制为阻断RAS，减少血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的产生。本研究以Wistar大鼠作为研究对象，采用一次性尾静脉注射阿霉素方法建立阿霉素肾病模型，模型大鼠分别给予奥美沙坦酯和他克莫司治疗12周，结果显示，奥美沙坦酯组和他克莫司组24h尿蛋白定量均较ADR组明显降低，证明奥美沙坦酯及他克莫司均具有减少尿蛋白的作用，这与既往的研究结论一致[15-16]。且他克莫司减少尿蛋白的疗效优于奥美沙坦酯。ACEI类药物可减少AngⅡ的产生，也具有抗氧化的作用。局部AngⅡ与血管紧张素Ⅱ1型受体(AngⅡ1)结合后可激活NADH/NADPH氧化酶，使O2－、H2O2等ROS类物质生成增多。AngⅡ还可作用于血管内皮细胞，刺激其产生ROS增加，从而使血浆氧化应激水平升高[17-18]。本研究结果显示，在分别给予奥美沙坦酯和他克莫司治疗4、8及12周后，奥美沙坦酯组及他克莫司组氧化应激反应均较模型组明显减弱，且他克莫司减弱氧化应激的作用较奥美沙坦酯更加明显，表明他克莫司能有效减轻氧化应激对肾脏的损害，其对肾脏的保护作用优于奥美沙坦酯。有动物实验结果表明，AngⅡ可下调klotho在肾脏中的表达[19]。糖尿病肾病大鼠给予缬沙坦治疗后，其肾脏组织中klotho蛋白表达水平升高而氧化应激反应降低[15]。另有研究表明，在慢性肾衰竭病人体内，klotho的表达量明显下降，RAS和氧化应激激活可抑制klotho在肾脏表达[20]。其机制可能是klotho通过抑制胰岛素样/胰岛素样生长因子-1介导的FoxO磷酸化而活化FoxO转录因子[21-22]，去磷酸化的FoxO能够反过来上调抗氧化酶如过氧化氢酶-1和SOD的表达。本研究结果显示，在实验第4周末，ADR组大鼠肾组织中klotho的表达开始降低，第8、12周末降低更加明显；分别给予奥美沙坦酯和他克莫司灌胃治疗后，模型大鼠klotho的表达升高。实验第4、8、12周末，OLM组和FK506组大鼠肾组织中klotho的表达均较ADR组显著增加，且FK506组较OLM组增加更加明显。
综上所述，阿霉素肾病大鼠klotho表达下降与肾病综合征的发生、发展密切相关；在阿霉素肾病大鼠模型中，奥美沙坦酯和他克莫司均具有抑制氧化应激反应、提高肾组织中klotho表达进而达到保护肾脏的作用，但他克莫司保护肾脏的作用优于奥美沙坦酯。这两种药物的长期疗效、安全性及肾脏保护作用的具体分子机制目前尚不清楚，还需进一步研究。
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