皮肤是身体的第一道防线,大多数的皮肤轻微损伤可以自我修复,当皮肤损伤严重时,不能完全再生,创面形成瘢痕甚至延迟愈合或者不愈合。大面积或深层的皮肤损伤严重威胁人类健康,因此促进伤口愈合和减少瘢痕形成显得尤为重要[1]。皮肤损伤后的愈合过程是一个由多种组织细胞、细胞因子、炎性细胞等共同参与且互相作用的极其复杂的生物学过程[2-3]。水凝胶是由亲水性聚合物交联而成的三维网状结构,能够承载细胞,并依靠其各种理化生物特性为处于其中的细胞营造微环境,从而促进伤口愈合。本研究根据透明质酸(HA)和胶原蛋白肽(CP)的理化性质,用丙烯酸酐加成的方法对狭鳕鱼皮CP-HA进行处理制成负载重组人表皮生长因子(EGF)的水凝胶材料,将其贴敷于模型大鼠皮肤创面,观察水凝胶对伤口愈合及瘢痕形成的影响,以探索一种使用安全、成本低廉的促进伤口愈合及减少瘢痕形成的组织工程材料。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物出生60 d左右的清洁级雄性SD大鼠90只,体质量220~250 g,购于青岛大任富城畜牧有限公司。大鼠单笼饲养,环境温度15~22 ℃、湿度50%~60%,实验前适应环境饲养1周。
1.1.2 主要试剂狭鳕鱼皮CP粉由青岛福生食品公司和青岛大学医学院馈赠;HA粉末、透析袋购自北京索莱宝科技有限公司;MTT、甲基丙烯酸酐(MA)、三乙胺、N-二甲基甲酰胺(DMF)、光引发剂I2959均购自美国Sigma-aldrich公司;兔抗血管内皮生长因子-α(VEGF-α)和转化生长因子-β1(TGF-β1)单克隆抗体购自英国Abcam公司,山羊抗兔二抗购自北京中杉金桥公司。
1.2 CPMA和HAMA的合成① CPMA的合成:将4 g CP粉加入到100 mL蒸馏水中,搅拌至充分溶解,将溶液的pH值调至7.4。加入30 mL的DMF,溶解后再加入4 g三乙胺搅拌至充分溶解,再加入10 mL的MA,在持续搅拌中反应48 h,并在反应过程中加入0.5 g碳酸氢钠,最后调节pH值至7.4。反应结束后的溶液用截留分子量为1 000的透析袋透析3 d,然后用真空冷冻干燥机冻干后储存备用。②HAMA的合成:将4 g的HA粉末加入到100 mL蒸馏水中,其余操作步骤同CPMA的合成。
1.3 水凝胶的制备① HA水凝胶:在无菌的条件下应用PBS将HAMA配制成浓度为10 g/L的溶液。②CP-HA水凝胶:应用PBS配制成CPMA浓度为30 g/L和HAMA浓度为10 g/L的溶液。③EGF-HA水凝胶:在浓度为10 g/L的HAMA溶液中加入终浓度为1 mg/L重组人EGF。④EGF-CP-HA水凝胶:用PBS配制成CPMA浓度为30 g/L和HAMA浓度为10 g/L的溶液,加入终浓度为1 mg/L的重组人EGF。在以上4种溶液中分别加入终浓度为1 g/L的光引发剂I2959,充分混匀后,加入到模具中,用365 nm波长紫外线照射15 min,待其形成固体的水凝胶后取出备用。整个操作过程均在无菌环境下进行。
1.4 动物模型的制备及分组用手术切割方法造模,在造模前2 d于大鼠背部脊柱两侧用80 g/L硫化钠脱毛备皮。术前腹腔注射20 g/L戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉大鼠,取俯卧位暴露大鼠背部,铺无菌巾,术区常规用碘附消毒后,在距脊柱正中两侧旁开1 cm处用直径1.2 cm的角膜环钻做全层皮肤缺损创面,左右各1个,止血并用生理盐水冲洗伤口,消毒后备用。将90只SD大鼠,随机分为NS组(A组)、HA水凝胶组(B组)、EGF-HA水凝胶组(C组)、CP-HA水凝胶组(D组)和EGF-CP-HA水凝胶组(E组),每组18只。后4组大鼠在伤口处贴敷相应水凝胶治疗,然后在伤口周缘缝合包扎涂抹凡士林的无菌纱布,遮盖水凝胶及伤口,防止水凝胶脱落和伤口感染。
1.5 创面愈合情况观察及实验样本采集从造模当天(第0天)开始,每隔3 d使用佳能70D相机拍照,观察创面愈合情况。用Image-pro plus 6.0图像分析软件测量伤口面积,计算伤口创面愈合率。伤口创面愈合率=(建模后伤口面积-现在剩余伤口面积)/建模后伤口面积×100%。以伤口创面愈合率>90%为愈合标准。分别于第3、7、11、14、21、28天每组随机选取3只大鼠,麻醉后取伤口及其周缘1 cm的包含皮肤和皮下组织的标本,用40 g/L多聚甲醛溶液固定。
1.6 组织学观察将组织标本常规脱水后进行石蜡包埋,制成5 μm厚的组织切片。根据标准流程进行常规苏木精-伊红染色、Masson三色染色,光镜下观察。
1.7 免疫组化染色将石蜡切片常规脱蜡至水;加入柠檬酸钠溶液在微波炉中进行抗原修复;以PBS漂洗3次,每次5 min;用内源性过氧化酶封闭液(体积分数0.03 H2O2)37 ℃封闭10 min;室温下以PBS漂洗3次,每次5 min;用体积分数为0.10的山羊血清封闭10 min;分别滴加兔抗VEGF-α单克隆抗体(稀释度1:80)和兔抗TGF-β1单克隆抗体(稀释度1:100),4 ℃过夜;以PBS漂洗3次,每次5 min;加山羊抗兔二抗室温孵育1 h;以PBS洗3次,每次5 min;加入二氨基苯乙胺在光学显微镜下控制显色,用自来水冲洗终止显色;苏木精复染,脱水,中性树胶封片。以棕黄色深染为免疫组化染色阳性,应用OLYMPUS光学显微镜采集图片,用ipp 6.0软件进行半定量分析。
1.8 统计学处理采用GraphPad Prism 7.0软件进行统计学分析,计量数据以x±s表示,多组间比较采用单因素和重复测量设计方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 创面愈合时间和愈合率EGF-CP-HA组创面愈合时间明显短于NS组,差异有统计学意义(F=6.46,P<0.01)。时间与贴敷水凝胶无交互作用(F=2.19,P>0.05)。与NS组相比,应用水凝胶各组术后第3、7、11天的创面面积均有不同程度减小,以EGF-CP-HA组减小最明显。EGF-CP-HA组术后第3、7、11天的创面愈合率与NS组相比较差异具有统计学意义(F=26.48~56.31,P<0.01)。见表 1。
表 1 各组创面愈合时间及创面愈合率比较(n=6, x±s) |
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术后第3天,各组创面渗出液明显减少,创面均被血痂皮覆盖,伤口开始收缩变小,伤口周围干燥,肿胀减轻。随着时间的延长,应用水凝胶各组伤口创面减小的速度明显快于NS组,其中以EGF-CP-HA组促进伤口愈合的效果最明显。术后第12天,EGF-CP-HA组伤口达到愈合标准,其余组未达到愈合标准。术后第28天,各组创面均已愈合,EGF-CP-HA组创面与周边皮肤差别不明显,无明显瘢痕凸起,伤口愈合区域有大量新生毛发;其他组伤口周缘清晰,可见瘢痕组织形成,无明显毛发生长。
2.3 组织学观察苏木精-伊红染色显示,术后第3天,各组创面均有大量的肉芽组织形成并向伤口内生长,创面区域可见大量的毛细血管生成,大量的巨噬细胞和中性粒细胞浸润,胶原纤维生成,但尚无完整表皮覆盖创面,EGF-CP-HA组炎性反应较其他组轻,毛细血管及胶原纤维生成较其他组多。术后第14天,HA水凝胶组、EGF-HA水凝胶组和CP-HA水凝胶组创面炎性细胞浸润较NS组减少,胶原纤维相对杂乱,肉芽组织向瘢痕组织转变,而EGF-CP-HA组创面有完整的表皮覆盖创面,创面有少量炎性细胞,胶原纤维排列更加整齐、规则。术后第21天,各组均有完整的表皮覆盖创面,增厚的再生表皮与真皮层之间有明显的界限,胶原纤维较之前排列整齐,炎症细胞浸润不明显,未见明显新生皮脂腺形成;与其他组相比,EGF-CP-HA组创面再生表皮形态更接近正常的表皮,有新生的毛囊形成,但其数量和密度较正常皮肤低。
Masson三色染色将结缔组织和胶原纤维染成蓝色,平滑肌染成红色,细胞核染成褐色。术后第3、14、21天,各组均有胶原纤维在组织中生成;术后第14、21天,EGF-CP-HA组胶原纤维数量最多,对照组最少;术后第21天,EGF-CP-HA组胶原纤维数量较其他组多,排列规则、有序,更接近正常皮肤。
2.4 创面组织TGF-β1和VEGF-α的表达术后第3、7、11天,各组大鼠皮肤创面组织中TGF-β1和VEGF-α的表达比较,差异均有统计学意义,以EGF-CP-HA组的表达最多,NS组的表达最少(F=12.51~18.64,P<0.05)。见表 2。
表 2 各组大鼠不同时间点皮肤创面组织TGF-β1和VEGF-α的表达(n=6,A,x±s) |
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取术后第11天的组织切片,应用VEGF-α免疫组化染色法标记毛细血管,结果显示,NS组、HA水凝胶组、EGF-HA水凝胶组、CP-HA水凝胶组和EGF-CP-HA水凝胶组大鼠的毛细血管数分别为6.51±1.29、7.75±0.96、8.52±1.00、9.50±1.29和11.53±1.29(n=6),与NS组相比,应用水凝胶各组新生血管数均有增加,以EGF-CP-HA组增加最明显,差异具有统计学意义(F=6.53,P<0.01)。
3 讨论伤口创面愈合是一个由多种细胞和组织成分参与的高度复杂、协同的过程,包括各种组织的再生、肉芽组织增生和瘢痕组织形成等,可分为急性炎症期、炎症反应期、组织增生期和组织重塑期等4个主要阶段[4-6],但4个阶段无明显界限、互相重叠。参与创面修复的细胞包括巨噬细胞、中性粒细胞、血小板、血管内皮细胞、表皮角质形成细胞、真皮成纤维细胞、外根鞘细胞、神经细胞及脂肪细胞等[7-8]。这些细胞所释放出来的各种细胞因子和生长因子直接参与了创面修复的各个阶段[9-11]。
在全层皮肤伤口中,基底膜破裂,皮肤附属器官(皮脂腺、汗腺和毛囊等)被破坏。创面愈合时,上皮细胞迁移至伤口边缘,肉芽组织填充创面床,此时成纤维细胞迅速浸润皮肤伤口,成纤维细胞的浸润对于诱导早期炎症反应以促进皮肤伤口再上皮化非常重要[12]。炎症过程与创面愈合直接相关,炎症细胞因子刺激创面再上皮化,促进创面愈合[13]。EGF可通过促进内皮细胞和成纤维细胞的增殖,加速包括皮肤在内的各种组织的伤口再生[14]。实验已证明,水凝胶负载重组人EGF的浓度为1 mg/L时最有利于皮肤伤口的恢复[15]。通过在CP-HA水凝胶中培养人脐带间充质干细胞实验,目前可以大致认为CPMA浓度为30 g/L、HAMA浓度为10 g/ L是一个较为适宜的制备凝胶浓度[16]。
本文创面愈合时间结果显示,应用水凝胶各组均可以不同程度加快创面愈合,以EGF-CP-HA组效果最明显。考虑原因可能为:EGF-CP-HA水凝胶能为创面保湿,在创面上形成保护层,防止皮肤缺损部位与外界的大面积接触,减少创面感染的概率,为创面愈合创造更好的条件;EGF-CP-HA水凝胶可以持续缓慢释放重组人EGF,其中的HA在组织生长、发育、伤口愈合和消除炎症等方面有巨大作用,且狭鳕鱼皮CP具有良好的生物相容性,可通过促进成纤维细胞增殖、蛋白合成,提高M2型巨噬细胞含量,促进大鼠伤口的愈合[17]。
VEGF又称为血管通透因子,是一种诱导血管生成的多功能生长因子。它能特异性地促进血管内皮细胞分裂、增殖,增强血管通透性以及诱导血管生成等,而VEGF-α是目前已知的促进血管生成效果最显著的因子[18]。本实验结果显示,VEGF-α在大鼠皮肤创面及其周缘的中性粒细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、皮脂腺上皮细胞、毛囊中均有表达,但以在成纤维细胞中的表达为主,与NS组相比较,应用水凝胶各组VEGF-α的表达量均明显增加,且以EGF-CP-HA组的表达量最高。CORRAL等[19]的研究结果显示,损伤后的皮肤中VEGF mRNA的表达量可提高6~7倍,提出VEGF在皮肤创伤修复过程中的作用重大。
TGF-β1是已知的效果最显著的促纤维化因子,在伤口创面愈合整个过程中起着非常重要的作用,它不仅可促进成纤维细胞快速增殖,而且能够促进多种细胞分泌胶原、HA等细胞外基质成分,从而促进肉芽组织的形成、肌成纤维细胞转化及再上皮化[20]。本实验中,术后第3、7、11天,应用水凝胶各组大鼠皮肤创面组织中TGF-β1的表达均较NS组显著增高,且以EGF-CP-HA组的表达量最高,表明外源性应用重组人EGF能够提高创面周缘部位TGF-β1的分泌[20],进而协同其他生长因子促进胶原的产生,减轻炎症反应,促进组织修复,最终加速伤口创面的愈合。
胶原蛋白作为一种重要的生物材料,已广泛应用于化妆品和医用生物材料领域。水产胶原蛋白没有口蹄疫、疯牛病等传染性疾病的病原,具有良好的生物相容性、无毒性、低抗原性和良好的生物降解性[21]。狭鳕鱼皮含有大量的胶原纤维,其中主要为Ⅰ型胶原,并含有特定的抗冻蛋白,可以作为生产较好胶原蛋白的原料。CP用于创面可以与血液中的血小板接触发生生化反应,产生血纤维,堵住伤口,减少出血;可以提高血红蛋白含量、红细胞数、红细胞体积和血小板数;还能刺激细胞分裂增殖、分化,促进伤口愈合。因此,狭鳕鱼皮是较好的胶原蛋白医用生物材料的来源。
综上所述,本研究将狭鳕鱼皮CP和HA通过丙烯酸酐接枝处理后,加入重组人EGF,在温和的条件下交联成凝胶,并将其覆盖于大鼠全层皮肤缺损创面,结果显示,该水凝胶能通过促进成纤维细胞增殖以及胶原蛋白、VEGF-α、TGF-β1的表达,对伤口愈合起到促进作用,并减少瘢痕形成,其临床应用价值值得进一步深入研究。
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