糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)最严重和常见的慢性并发症之一，研究显示其为导致终末期肾病(ESRD)的最常见病因^[1-2]。因此，防治DN、延缓肾功能的减退，越来越受到医学界关注。足细胞、肾小球毛细血管内皮细胞与肾小球基底膜共同构成肾小球滤过屏障，足细胞在肾小球滤过功能中发挥着重要作用。足细胞病变是DN发病机制的中心环节及影响DN病人预后的主要因素之一^[3-4]。高葡萄糖干预足细胞、钙离子内流增加诱发足细胞凋亡^[5]。Nephrin与podocin等分子共同参与裂孔隔膜信号转导^[6]。检测Nephrin的表达可以评估DN足细胞病理损伤^[7]。近期有研究结果显示，microRNA-26a (miR-26a)在狼疮肾炎及IgA肾病病人肾小球足细胞中表达显著降低^[8]。miRNA是高度保守的小非编码RNA家族，可以通过降解或抑制翻译下调靶蛋白的表达^[9-10]。然而，目前miR-26a与DN足细胞病变的关系国内外研究甚少。本课题通过构建2型糖尿病(T2DM)模型研究miR-26a在DN中的表达水平，探讨miR-26a与DN的关系，为DN防治提供依据。现将结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 DN大鼠模型的制备及分

清洁级SD雄性大鼠30只，体质量为180~220 g(青岛大学附属医院动物实验室提供)，SPF级环境饲养，环境温度为(22±2)℃、相对湿度45%~65%，每日光照12 h。随机分为正常对照组(NC组，n=10)和T2DM组(n=20)。NC组常规饲料喂养；T2DM组给予高脂高糖饮食(Research Diet公司，USA，每100 g饲料含：常规饲料66.5 g，蔗糖20.0 g，猪油10.0 g, 胆固醇2.5 g，胆酸盐1.0 g)喂养8周后，联合小剂量链脲佐菌素(30 mg/kg，Sigma，USA)一次性腹腔注射1周后，于禁食不禁水12 h后鼠尾静脉取血，测定空腹血糖(FBG)及空腹胰岛素(FINS)，并计算胰岛素敏感指数(ISI)。以FBG≥NC组大鼠FBG均值+3个标准差(血糖≥10.0 mmol/L)及ISI≤NC组大鼠的均值为T2DM模型建立成功^[11-12]。

1.2 血液和尿液生化指标检测

T2DM造模成功后，继续高脂喂养8周，用代谢笼收集大鼠24 h尿液以测定清蛋白和肌酐，测鼠尾收缩压(SBP)并采集大鼠尾静脉血。参照相关文献方法^[11]，检测大鼠血标本FBG、胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、血肌酐(Scr)，尿液标本尿肌酐(Ucr)、24 h尿蛋白定量。根据Ucr、Scr计算内生肌酐清除率(Ccr)^[13]。Ccr=Ucr/Scr×24 h尿量。用ELISA检测试剂盒(Novus公司，美国)检测FINS，按说明书方法操作，用酶标仪检测450 nm波长处吸光度。

1.3 大鼠肾脏组织病理检查

处死大鼠，取部分肾皮质用40 g/L多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，4 μm切片，苏木精-伊红(HE)染色后光镜下观察肾组织病理学变化。

1.4 实时定量PCR检测Nephrin mRNA表达

采用TRIZOL试剂(TaKaRa公司，日本)提取肾皮质总RNA，通过紫外线分光光度计检测RNA的浓度和纯度。应用RNA反转录逆转录试剂盒(TaKaRa公司，日本)合成cDNA。以GAPDH作为内参照，应用实时荧光定量PCR仪(美国ABI 7500)进行PCR扩增，引物由TaKaRa公司合成，引物的序列见表 1。实时定量PCR反应条件为：95 ℃、10 min，95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，扩增45个循环。用2^－△△CT计算相对表达量，△△CT=(CT_{实验组目的}－ CT_{实验组内参})－(CT_{对照组目的}－CT_{对照组内参})。每个实验组均重复检测3次。

1.5 Western

blot技术检测Nephrin蛋白表达裂解肾皮质，用BCA试剂盒测定蛋白浓度，蛋白煮沸变性。取30 μg总蛋白，行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，室温下以5 g/L脱脂奶粉封闭1 h，加一抗摇匀后置于4 ℃冰箱内孵育过夜。一抗Nephrin(1:1 000, 美国Novus)，一抗GAPDH(1:2 000, 英国Abcam)。TBST洗膜3×12 min后加入二抗(1:10 000, 中国Elabscience)室温摇床孵育1 h。电化学发光液(ECL)显色并扫描结果。所有实验均进行3次。用Image J软件分析实验条带。

1.6 统计学分析

应用SPSS 22.0软件进行统计学分析, 符合正态分布的计量资料结果用x±s表示，两组数据比较用t检验；相关性分析用Pearson分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 两组大鼠一般情况比较

本文14只大鼠T2DM造模成功，造模成功率70%。T2DM组大鼠的FBG、TC、TG、SBP、LDL、Ccr、24 h尿蛋白定量较NC组明显升高，ISI、HDL显著低于NC组，差异有统计学意义(t=5.387~28.421, P < 0.05);而两组间Scr差异则无统计学意义(P>0.05)。见表 2。

2.2 两组肾脏组织病理比较

NC组大鼠肾小球结构完整、清晰，并无明显异常。与NC组比较，T2DM组大鼠肾小球体积增大，基底膜增厚，系膜区扩大，肾小球毛细血管腔受压变窄。

2.3 两组Nephrin mRNA及miR-26a表达比较

与NC组相比较，T2DM组Nephrin mRNA、miR-26a表达量减少(t=12.270、9.070，P < 0.05)，见表 3。Pearson分析表明，miR-26a与Nephrin表达正相关(r=0.65，P < 0.01)。

2.4 两组Nephrin蛋白表达比较

与NC组比较，T2DM组Nephrin蛋白表达量减少(t=7.429，P < 0.05)。见图 1、表 3。

3 讨论

DN为1型和2型DM的严重并发症之一^[14]，最终可发展为ESRD^{[1, 15]}。目前关于DN发病机制尚不明确。足细胞是附着在肾小球基底膜外侧的终末分化的上皮细胞，是肾小球滤过屏障的重要组成部分^[16]。高糖通过刺激NADPH氧化酶和线粒体途径增加细胞内活性氧的产生，刺激钙调磷酸酶TRPC6激活，促使凋亡基因的活化导致足细胞凋亡，并且是导致小鼠1型DM和T2DM的早期病理机制^[17]。DKD大鼠模型肾脏足细胞钙调磷酸酶激活和活性氧增多可刺激TRPC6诱导的足细胞凋亡^[18]，而抑制TRPC6可降低NFAT mRNA改善高葡萄糖诱导的足细胞损伤，保护肾小球滤过屏障完整性^[19]。有研究表明，雷公藤多甙通过上调自噬和下调β-arrestin-1改善足细胞损伤，延缓小鼠DN发生^[20]。国外有研究证实，足细胞凋亡是DN发病机制中的中心环节^[3-4]。

Nephrin与podocin等分子共同参与足细胞裂孔隔膜信号转导^[5]。Nephrin的表达变化可以用来评估大鼠DN病变及足细胞的损伤^[7]。本文实验结果显示，T2DM组的造模成功率为70%，T2DM组FBG、TC、TG、SBP、LDL、24 h尿蛋白定量较NC组大鼠均明显升高，伴胰岛素抵抗；与NC组比较，T2DM组肾脏组织出现病理改变，Nephrin基因和蛋白表达降低，提示DN肾脏组织病理损伤。有研究显示，miR-26a在自身免疫性肾小球肾炎小鼠以及IgA肾病病人肾小球足细胞中表达显著降低^[8]，并且与非DN相关的肾小球足细胞损伤密切相关。miRNA是高度保守小非编码RNA家族，miRNA与靶mRNA的3′非翻译区(3′UTR)配对结合从而负向调节靶基因的表达，可通过降解或抑制翻译下调靶蛋白^[9-10]。国内外研究结果证实，miRNA参与多种肾脏疾病的发生发展，miR-23b在1型DM组及T2DM组外周血及肾脏组织中的表达下降^[21]；miR-146a在急性肾损伤组织的表达水平降低^[22]。在人和小鼠肾脏组织miR-26a呈高水平特异性表达^[23]，足细胞是小鼠肾脏中miR-26a表达的主要位点。目前国内外关于miR-26a与DN病变关系的研究甚少。本文研究结果表明，T2DM组miR-26a表达降低，并且miR-26a与Nephrin表达正相关，提示miR-26a表达降低与大鼠DN病变及足细胞的损伤密切相关。ICHII等^[8]的研究显示，miR-26a在小鼠自身免疫性肾小球肾炎中表达降低并与足细胞的损伤紧密相关，本文结果与其相一致。另有研究结果表明，miR-217通过靶向调节TNFSF11改变人足细胞的凋亡, 是膜性肾病一种有用的诊断生物标志物^[24]。尿miR-30c-5p和miR-192-5p为缺血再灌注诱导的肾损伤的潜在生物标志物^[25]。尿miR-377和miR-216a也是DN风险的生物标志物^[26]。因此推测miR-26a可能对DN诊断有一定价值，但需进一步研究证明。

综上所述，miR-26a在DN大鼠肾组织表达降低，并与大鼠DN病变及足细胞的损伤密切相关。目前，国外已有学者研究miR-26a在狼疮型肾小管间质炎症、肾衰竭、免疫性肾病等疾病表达变化及作用机制^{[8, 24]}。本实验研究miR-26a与DN足细胞损伤的关系，在国内外研究甚少。本课题后续将进一步深入研究miR-26a在DN足细胞损伤中的作用机制，为DN的治疗提供依据。