2019, Vol. 55
2. 青岛大学附属青岛妇女儿童医院妇科中心
子宫内膜癌(EC)是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，在某些发达国家其发病呈年轻化的趋势[1-2]。在中国EC的发病率近年来也呈现出上升趋势[3]。由于其发病机制尚未明确，对于临床晚期病人特别是复发转移者，目前的治疗手段仍较为局限。近年来，EC发生中肿瘤细胞内信号通路的异常受到学者们广泛关注[4-6]。多数研究证实，趋化因子CXCL12及其受体CXCR4、CXCR7在多数肿瘤的发生发展中起重要作用，尤其是其在EC生物学行为中的作用及其机制成为目前研究的热点[7]。已有研究证实，特异性小分子抑制剂靶向干预肿瘤细胞内信号通路，能够抑制EC细胞的增殖[8-9]。体外研究显示，趋化因子通路CXCL12/CXCR4、CXCR7在EC细胞生物学行为中发挥正向调控的重要作用，且CXCL12/CXCR4生物轴通过激活ERK通路上调Survivin蛋白表达，从而引发Ishikawa细胞一系列增殖和侵袭效应，而应用小干扰RNA靶向沉默CXCR4、CXCR7的表达后，Ishikawa细胞的增殖及侵袭能力均降低，并且在细胞周期中出现S期阻滞[10-12]。体内实验将化学合成的CXCR4-siRNA和(或)CXCR7-siRNA局部注射于荷瘤裸鼠瘤体内，结果显示靶向沉默CXCR4及CXCR7的表达后，体内肿瘤细胞的增殖能力明显受限[13]。本研究拟建立EC裸鼠移植瘤动物模型，模拟肿瘤在体内生长的微环境，将CXCR4特异性拮抗剂AMD3100(商品名普乐沙福)、ERK信号通路阻断剂PD98059、CXCR7中和抗体Anti-CXCR7经腹腔注射于荷瘤裸鼠体内，观察移植瘤的生长情况并检测瘤体组织内凋亡抑制基因Survivin的表达，探讨AMD3100、PD98059、Anti-CXCR7对EC裸鼠皮下移植瘤生长的影响。现将结果报告如下。
1 材料和方法 1.1 细胞及实验动物来源EC Ishikawa细胞由青岛大学附属医院中心实验室提供。SPF级雌性BALB/c裸鼠30只，4~5周龄，体质量14~18 g(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，饲养于青岛大学医学部SPF级动物中心，适应1周后用于实验。
1.2 主要试剂DMEM高糖培养基(Hyclone公司，美国)，胎牛血清(PAN，德国)，青链霉素混合液、2.5 g/L胰蛋白酶消化液(北京索莱宝，中国)，Matrigel基质胶(B & D，美国)；AMD3100、PD98059(MCE公司，美国)，Anti-CXCR7(Abcam，英国)，TRIzol(Invitrogen, 美国)，逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa，日本)。Survivin和GAPDH PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。
1.3 实验方法 1.3.1 Ishikawa细胞培养将Ishikawa细胞培养于含有体积分数0.10胎牛血清、10 g/L青链霉素混合液的DMEM完全培养基中，于恒温37 ℃、含体积分数0.05的CO2的培养箱中培养，待细胞铺满培养瓶底75%~85%时，使用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代培养。
1.3.2 动物模型建立及分组离心收集Ishikawa细胞后PBS重悬，将细胞悬液与Matrigel基质胶1:1混匀调整细胞密度为7.5×1010/L。裸鼠置于超净工作台内，消毒皮肤后，将细胞悬液200 μL(约1.5×107个细胞)注射于裸鼠右侧背部肩胛皮下，于SPF环境中饲养。每天观察裸鼠状态、注射部位肿瘤大小及硬度。1周后，观察所有裸鼠右侧肩胛背部皮下移植瘤(直径>5 mm)，将荷瘤裸鼠随机分为AMD3100组(6 mg/kg)、PD98059组(50 mg/kg)、Anti-CXCR7组(1 μL)、AMD3100+Anti-CXCR7组(6 mg/kg AMD3100+1 μL Anti-CXCR7)、对照组(生理盐水)，每组6只。各组分别经腹腔注射相应药物，每3 d注射1次，共3周。
1.4 观察指标 1.4.1 裸鼠移植瘤生长情况每次用药前分别用游标卡尺测量肿瘤的长径(a)、短径(b)，根据公式(V=ab2/2)计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。治疗结束后，脱颈处死所有裸鼠，于超净工作台内剥离瘤体，去除脂肪及血污后称质量，计算抑瘤率。抑瘤率(%)=(对照组瘤质量－治疗组瘤质量)/对照组瘤质量×100%。按照金氏公式计算q值以协助验证联合用药是否有叠加抑瘤效应，q < 0.85表示联合用药有拮抗作用，q＞1.15表示有协同作用，q值0.85~1.15表示有相加作用[14]。
1.4.2 实时荧光定量RT-PCR检测各实验组瘤体组织Survivin mRNA表达用TRIzol试剂提取移植瘤组织中的总RNA，使用分光光度计(IMPLEN, 德国)检测样本中RNA浓度及纯度。根据逆转录试剂盒说明合成cDNA，按荧光定量PCR说明书加入相应体积引物后，置于LightCycler PCR仪(Roche, 瑞士)中进行Real Time PCR反应。应用LightCycler© 96分析软件自动计算出目的基因Survivin及内参GAPDH的Ct值，以2－△△Ct计算目的基因的相对表达量[15]。Survivin及GAPDH的引物序列见表 1。实验重复3次。
| 表 1 Survivin及GAPDH引物序列 |
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采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计量资料结果用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组移植瘤的生长情况比较治疗期间，各组裸鼠生长良好，饮食、大小便、精神状态可，无皮肤溃烂及意外死亡。各组裸鼠治疗前体质量、肿瘤体积比较差异无显著统计学意义(P>0.05);治疗后AMD3100组、PD98059组、Anti-CXCR7组、AMD3100+Anti-CXCR7组的肿瘤体积与对照组相比均显著降低，差异有统计学意义(F=72.27, P < 0.05);但AMD3100组、PD98059组、Anti-CXCR7组、AMD3100+Anti-CXCR7组肿瘤体积差异无显著性(P>0.05)。见表 2、图 1。
| 表 2 治疗前后各组体质量及肿瘤体积比较(n=6, x±s) |
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| 图 1 各组裸鼠皮下移植瘤生长曲线 |
与对照组比较，AMD3100组、PD98059组、Anti-CXCR7组、AMD3100+Anti-CXCR7组的肿瘤质量均明显减少，差异有统计学意义(F=11.35，P < 0.01)；4个组间肿瘤质量比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表 2。
2.3 各组抑瘤率比较AMD3100组、PD98059组、Anti-CXCR7组、AMD3100+Anti-CXCR7组抑瘤率与对照组相比均明显升高，差异有显著性(F=22.94，P < 0.01)，但4组间的抑瘤率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表 3。应用金氏公式计算得出q=0.60，提示联合用药有拮抗作用。
| 表 3 各组移植瘤质量、抑瘤率及瘤体组织Survivin mRNA表达比较(n=6, x±s) |
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本文AMD3100组、PD98059组、Anti-CXCR7组和AMD3100+Anti-CXCR7组移植瘤组织内的Survivin mRNA的相对表达量均较对照组明显下调，差异有统计学意义(F=17.16，P < 0.01)，4组间Survivin mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表 3。
3 讨论EC好发于围绝经期和绝经后女性，严重影响女性身体健康及生活质量，早期EC经手术治疗有明显改善，但发生远处转移及复发病人即使采用联合放化疗和(或)激素治疗，也不能明显改善预后。近年来，随着对肿瘤分子机制和信号通路研究的深入，越来越多的学者开始关注小分子靶向药物在EC治疗中的应用，并取得了一定的效果。有研究发现，在EC中PI3K/AKT/mTOR通路的改变最为常见，该信号通路的激活与EC发展及不良预后有关，它似乎存在于所有实体瘤中[16]。临床上，对于复发、要求保留生育功能的EC病人，分子靶向药物治疗成为重要选择，这些药物包括酪氨酸激酶(TK)抑制剂[17]、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路抑制剂[18]、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)抑制剂[19]、蛋白激酶B(Akt)抑制剂[20]、PI3K/mTOR双重抑制剂[21]、血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂[22]、表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂[23]、人类表皮生长因子受体(HER2/neu)抑制剂[24]。
CXCL12/CXCR4、CXCR7生物轴及ERK-1/2信号传导通路在EC的发生发展中起重要作用，应用相应的抑制剂靶向阻断该通路，能够抑制EC细胞的增殖，说明该通路的特异性阻断剂有望成为治疗EC的靶向药物。早在2006年，REDJA等[25]就报道应用CXCR4特异性阻断剂AMD3100抑制CXCL12/CXCR4信号传导，研究其对体内胶质瘤生长的抑制作用，并取得成功。而IERANO等[26]研究结果证实，CXCR4拮抗剂和CXCR7拮抗剂通过干扰CXCL12/CXCR4、CXCR7轴影响肾癌细胞mTOR信号通路的生物学效应而用于肾细胞癌的治疗；并且有研究证实，CXCR4和CXCR7可预测肾细胞癌的预后[27-28]。还有研究表明，肿瘤相关成纤维细胞通过分泌基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α，又称趋化因子CXCL12)促进EC细胞的增殖、迁移和侵袭，而这一作用能够被CXCR4特异性拮抗剂AMD3100显著抑制[7]。CXCR7为CXCL12的另一种重要受体，与CXCR4相比，其与CXCL12亲和力更高。GU等[29]的研究显示，CXCR7 mRNA和蛋白在EC细胞系Ishikawa及原发性EC组织中均高表达，在体外实验中siCXCR7能够沉默EC细胞系及组织中CXCR7的表达，降低CXCR7导致的肿瘤细胞增殖的能力。郭瑞霞等[9]体内实验的结果也显示，ERK抑制剂PD98059通过阻断MAPK/ERK信号传导通路，增加EC细胞系Ishikawa和HEC-1A细胞裸鼠移植瘤组织中肿瘤细胞的凋亡, 抑制肿瘤的生长。我们前期的研究结果也证实，ERK信号通路在EC细胞增殖和侵袭中起重要作用，通过CXCL12/CXCR4生物轴激活ERK信号通路上调Survivin蛋白和MMP-2蛋白表达可引发Ishikawa细胞的增殖和侵袭[10]。研究显示，Survivin蛋白在83%的EC中表达上调，下调Survivin蛋白表达能够增加Ishikawa细胞的凋亡[30]；CXCL12/CXCR4、CXCR7轴在EC组织及细胞中高表达，采用siRNA靶向沉默CXCR4和(或)CXCR7基因表达后，能够抑制体内外EC细胞的增殖[10-13]。
然而，目前关于多种小分子靶向抑制剂用于体内EC的研究较少，并且抑制剂在体内发挥作用的机制尚未明确。本文研究通过建立裸鼠EC移植瘤模型，将CXCL12下游通路的4种分子靶向抑制剂AMD3100、PD98059、Anti-CXCR7以及AMD3100+ Anti-CXCR7用于体内治疗。结果显示，与对照组比较，靶向抑制剂干预各组瘤体生长速度及体积均明显减小，瘤体组织Survivin mRNA的表达也明显下调，说明这些靶向抑制剂的抑瘤作用可能与凋亡抑制基因Survivin的下调有关。此外，本文结果还显示，AMD3100、Anti-CXCR7联合应用或者单用都能够抑制裸鼠皮下移植瘤的生长，下调瘤体组织Survivin的表达，但二者联合应用并不能产生协同抑瘤作用，这可能与存在不同信号通路的相互拮抗作用有关，与我们之前联合使用CXCR4-siRNA和(或)CXCR7-siRNA进行体内实验的结果相一致[13]，说明趋化因子CXCL12与其受体CXCR4、CXCR7形成的信号通路可能相互影响。
综上所述，趋化因子生物轴CXCL12/CXCR4、CXCR7下游的靶向抑制剂AMD3100、PD98059和Anti-CXCR7均能抑制人EC Ishikawa细胞裸鼠皮下移植瘤的生长，且能下调瘤体组织凋亡抑制基因Survivin的表达。CXCR4、CXCR7趋化因子受体拮抗剂以及ERK通路抑制剂有望成为治疗EC的新型小分子靶向抑制剂，为临床治疗EC提供更多选择。现阶段，已经开发出拮抗CXCR4的小分子拮抗剂，其中一些正处于临床试验阶段。普乐沙福(AMD3100)目前已被批准应用于临床治疗非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤[31]，但其应用于EC的治疗还需要进一步的研究。本研究结果为CXCL12/CXCR4、CXCR7通路的靶向抑制剂用于治疗EC提供了实验支持。
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