衰老是一个复杂的过程，随着年龄的增加，机体发生退行性改变，进而引起各种衰老相关疾病。目前，世界人口老龄化加剧，随着老龄人口的增加，衰老相关疾病逐渐增多，其中心血管疾病是导致老年人死亡的主要原因^[1-2]。机体衰老后心脏会发生一系列病理性改变，如心肌纤维化、心肌肥厚、心功能不全等^[3]。有研究表明，随着细胞衰老P21和P53蛋白表达增加，二者可作为衰老检测的标志性蛋白^[4-6]。自噬是一种存在于细胞内的降解机制，可以清除细胞内受损的蛋白和细胞器，对细胞内稳态的调节至关重要^[7-8]。衰老心肌细胞自噬调节能力降低，导致细胞内错误折叠蛋白和功能障碍的细胞器大量累积^[9]。研究表明，提高心肌细胞自噬水平可以延缓心脏衰老^[10]。甘露糖醛酸寡糖(M3K)是褐藻胶寡糖的一种，由来源于海洋褐藻的褐藻胶加工而成，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种生物学活性，有重要的临床应用价值^[11-13]。过氧化氢(H₂O₂)属于活性氧簇家族，可引起氧化应激，诱导细胞衰老，现已被广泛用于体外衰老模型的建立^[14-15]。本实验采用H₂O₂诱导建立心肌细胞衰老模型，探讨M3K对衰老心肌细胞的保护作用及其可能机制。

M3K由中国海洋大学医药学院实验室惠赠。心肌细胞H9c2购于中国科学院上海细胞库。胎牛血清(FBS)购于美国Gibco公司，DMEM培养液购于美国Hyclone公司，P21兔单克隆抗体和P53小鼠单克隆抗体购于美国Cell Signaling Technology公司，山羊抗兔IgG二抗和山羊抗鼠IgG二抗购于武汉伊莱瑞特公司，RIPA裂解液和BCA蛋白浓度测定试剂盒购于上海碧云天公司，ECL发光液购于美国Millipore公司，逆转录试剂盒和Mix购于瑞士Roche公司。

将H9c2心肌细胞接种于6孔板中，用含体积分数0.10 FBS和10 g/L青-链霉素的DMEM完全培养液，在37 ℃、含体积分数0.05 CO₂的细胞培养箱中培养。实验分为5组：对照组(A组)，H₂O₂组(B组)，H₂O₂+M3K低剂量组(C组)，H₂O₂+M3K中剂量组(D组)，H₂O₂+M3K高剂量组(E组)。当细胞融合度达50%时，H₂O₂组、H₂O₂+M3K低剂量组、H₂O₂+M3K中剂量组和H₂O₂+M3K高剂量组细胞分别加入100 μmol/L的H₂O₂诱导建立衰老模型，4 h后更换新鲜DMEM完全培养液。H₂O₂组继续培养48 h，M3K干预各组分别加入10、50、100 mg/L的M3K培养48 h。实验过程中对照组仅进行同步换液处理。在倒置显微镜下观察，每孔随机选择3个区域进行镜下计数。收集细胞进行后续实验，所有实验均重复3次。

细胞中加入RIPA裂解液提取细胞蛋白，用BCA试剂盒检测蛋白浓度。每孔加入等量的蛋白进行SDS-PAGE电泳，待溴酚蓝到达分离胶底部时转移到PVDF膜上(200 mA，90 min)，用含30 g/L BSA和50 g/L脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭2 h，加入P21和P53一抗(均1:1 000稀释)，于4 ℃摇床孵育过夜；洗脱后分别加二抗(均1:5 000稀释)室温孵育2 h，用ECL发光液显影，凝胶成像系统成像后采用Quantity One软件分析条带灰度值。

采用Trizol法提取细胞总RNA，Nanodrop测定RNA含量和浓度，应用逆转录试剂盒将mRNA逆转录为cDNA。采用RT-PCR法进行扩增，扩增条件：95 ℃、600 s；95 ℃、10 s，60 ℃、10 s，72 ℃、15 s，共40个循环；95 ℃、10 s，65 ℃、60 s，97 ℃、1 s。以β-actin作为内参，用2^-ΔΔCt计算目的基因相对表达量。PCR引物序列见表 1。

表1(Table 1)

表 1 PCR引物序列

表 1 PCR引物序列 引物 序列(5′→3′) 长度(bp) beclin1 正义链AGGAGTTGCCGTTGTACTGTTCTG 186 反义链TGCCTCCAGTGTCTTCAATCTTGC Atg7 正义链GTGAACCTCAGCGGATGTATGGAC 136 反义链CCAGCAGCAGGCACTTGACAG LC3-Ⅱ 正义链AGACCTGCTGCTGGCCGTAG 171 反义链TGCTTCTTGAACTCACGTCGGATG β-actin 正义链ACCCAGAAGACTGTGGATGG 126 反义链CACATTGGGTAGGAACAC

应用SPSS 21.0软件进行统计学分析，计量数据以x±s表示，多组比较采用One-way ANOVA检验，组间两两比较采用LSD法。

培养48 h后，对照组细胞数量较多，融合度达90%；H₂O₂组细胞数量与对照组相比明显减少；M3K干预各组细胞数量与H₂O₂组相比呈剂量依赖性增加，差异均有统计学意义(F=8.685，P＜0.05)；H₂O₂+M3K高剂量组细胞数量与对照组相比差异无显著性(P＞0.05)。见表 2。

表2(Table 2)

表 2 各组心肌细胞数量及P21和P53蛋白表达比较(n=3，x±s)

表 2 各组心肌细胞数量及P21和P53蛋白表达比较(n=3，x±s) 组别 细胞数量(个) P21 P53 A组 298±25 1.000±0.000 1.000±0.000 B组 152±44 1.668±0.136 1.290±0.119 C组 230±27 1.334±0.080 0.901±0.149 D组 277±40 1.179±0.071 0.629±0.193 E组 300±41 0.996±0.084 0.487±0.201

与对照组相比，H₂O₂组心肌细胞P21和P53蛋白表达显著增加；与H₂O₂组相比较，M3K干预48 h后，H₂O₂+M3K低剂量组、H₂O₂+M3K中剂量组和H₂O₂+M3K高剂量组心肌细胞P21和P53蛋白表达随M3K浓度的增加而降低，差异均有显著性(F=31.507、13.111，P＜0.05)。见图 1、表 2。

图 1 各组心肌细胞P21和P53蛋白表达Western blot检测

与对照组相比，H₂O₂组心肌细胞beclin1、Atg7和LC3-Ⅱ mRNA表达水平显著降低；与H₂O₂组相比，M3K干预48 h后，H₂O₂+M3K低剂量组、H₂O₂+M3K中剂量组和H₂O₂+M3K高剂量组心肌细胞beclin1、Atg7和LC3-Ⅱ mRNA表达呈浓度依赖性增加，差异均有统计学意义(F=10.134~61.041，P＜0.05)。见表 3。

表3(Table 3)

表 3 各组心肌细胞beclin1、Atg7和LC3-Ⅱ mRNA表达比较(n=3，x±s)

表 3 各组心肌细胞beclin1、Atg7和LC3-Ⅱ mRNA表达比较(n=3，x±s) 组别 beclin1 Atg7 LC3-Ⅱ A组 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 B组 0.527±0.069 0.446±0.075 0.686±0.162 C组 0.716±0.039 0.725±0.083 0.814±0.091 D组 0.938±0.062 0.876±0.102 0.997±0.124 E组 1.226±0.088 1.306±0.085 1.306±0.176

衰老是导致老年人慢性疾病发生发展的重要危险因素，并且是心血管疾病发生的独立危险因素。近年来，随着老龄人口增加，衰老相关疾病给社会带来了巨大的医疗和经济负担。因此，探讨衰老相关机制、延缓衰老成为目前的研究热点^[16]。H₂O₂诱导的氧化损伤可以较好地模拟老年人体内氧化应激，现已被广泛用于衰老模型的建立^[17-18]。本实验用H₂O₂成功诱导了心肌细胞内氧化应激，引起细胞衰老。细胞衰老后表现为细胞周期阻滞，增殖减少。M3K属于海藻寡糖，具有多种生物学活性^[11]。本研究结果显示，用M3K干预衰老心肌细胞后，细胞周期阻滞延缓，增殖加快。

P21作为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子在衰老中起重要作用，它通过与细胞周期蛋白结合，导致细胞周期阻滞，阻断细胞增殖过程。细胞衰老后，P21蛋白表达增加，因此，P21可作为衰老标志物之一^[19-20]。本实验采用Western blot方法检测P21蛋白的表达，观察M3K对衰老心肌细胞的影响。结果显示，H₂O₂诱导心肌细胞衰老后P21表达增加，而用M3K干预衰老细胞48 h可使P21蛋白表达下调，缓解衰老心肌细胞的细胞周期阻滞，进而延缓心肌细胞衰老。P53是氧化应激的关键调控分子之一^[21]。P53作为“基因监护人”，可通过调节细胞周期阻滞、细胞凋亡和衰老发挥肿瘤抑制作用^[22]。有研究表明，p53基因过表达小鼠可以出现早衰表型^[23]。P53的表达与机体衰老呈正相关，机体衰老后，P53表达增加^[24-25]。本研究结果显示，P53在H₂O₂诱导的衰老心肌细胞中表达增加，而M3K干预衰老细胞可使P53蛋白表达下调，表明M3K可能延缓了H₂O₂诱导的心肌细胞衰老。

自噬可分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬3种类型，其中巨自噬是最常见的一种，其自噬过程依赖于溶酶体。LC3-Ⅱ、beclin1和Atg7是自噬溶酶体形成的关键蛋白，参与溶酶体膜的形成，自噬被激活后，三者的表达增加^{[7, 26]}。机体衰老后自噬调节能力也随之下降，细胞内受损蛋白质和细胞器大量积累，进一步加速衰老^[27-28]。已有大量的研究表明，激活自噬可能延缓组织和细胞衰老^[29]。为了探讨M3K延缓心肌细胞衰老是否与自噬的激活有关，本研究采用RT-PCR方法检测了自噬相关基因LC3-Ⅱ、beclin1和Atg7 mRNA的表达。结果显示，H₂O₂诱导的衰老细胞中LC3-Ⅱ、beclin1和Atg7 mRNA表达减少，而给予M3K处理后，细胞中LC3-Ⅱ、beclin1和Atg7 mRNA表达增加，表明M3K延缓心肌细胞衰老可能与自噬激活有关。

综上所述，M3K可以延缓H₂O₂诱导的H9c2心肌细胞衰老，其作用机制可能与细胞内自噬的激活有关，但其具体的分子机制还需要进一步研究。