肾细胞癌(RCC)是最常见的肾脏癌症，占所有成人恶性肿瘤的2%~3%^[1-2]。有20%~30%的病人被诊断为RCC时已经发现远处转移。此外，另有20%的病人接受肾切除术后会复发并发展成为转移性RCC ^[3-4]。转移性RCC病人生存率低，预后极差^[5-6]。乳头状肾细胞癌(PRCC)是第二常见的RCC类型，占所有RCC的10%~20%^[1]。PRCC可根据组织病理学特征进一步分为两种主要亚型^[7-9]。癌症基因组图谱(TCGA)是临床信息和基因测序数据的大型综合集合。既往RCC研究主要以透明细胞RCC为主，缺乏PRCC相关研究。为了探究PRCC涉及的信号传导途径和驱动基因并且进行系统分析，本文利用TCGA进行数据挖掘，筛选PRCC中差异表达基因及富集的信号通路。现将结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 实验样本信息收集

于TCGA数据库(https://cancergenome.nih.gov/)中收集与PRCC相关的RNA的测序数据(Level3)，包括289例PRCC组织和32例癌旁非癌肾组织。

1.2 筛选PRCC中异常表达的mRNAs

利用genecode数据库筛选mRNA测序数据，共涵盖20 271个mRNA数据。随后以R语言包edgeR计算异常表达的mRNAs(差异倍数＞2并且错误发现率(FDR)校正后P值< 0.01)。排除超过75%的样品中表达＜2的mRNA。

1.3 基因本体分析和富集途径分析

使用在线数据库DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)进行差异基因的基因本体分析和富集途径分析。基因本体分析和富集途径分析均以P值< 0.05作为临界标准。

1.4 基因集富集分析

基因组富集分析使用Java GSEA软件。基因组富集分析软件及注释基因集均由Broad研究所网站(http://www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)下载。基因集P < 0.05并且FDR < 0.25被认为具有统计学差异。

1.5 统计学处理

使用R语言(版本号3.5.1)中的edgeR包筛选PRCC和癌旁正常组织中不同表达的基因，筛选标准为FDR校正后P值< 0.01和差异倍数＞2的基因。对于GO和KEGG途径分析，其中P < 0.05的GO术语或途径是有统计学差异的。

2 结果 2.1 癌与癌旁配对样本差异表达的mRNA

对PRCC标本及癌旁正常组织的mRNA测序数据进行差异基因分析(差异倍数＞2并且FDR校正后P值< 0.01)，筛选4 639个差异表达的基因，在样品中2 638个mRNA转录物被上调并且2 001个mRNA转录物被下调。火山图见图 1。其中，PRCC及其癌旁正常组织中50种最具有表达差异的mRNA(从倍数变化最大到最小列出)见表 1。

利用在线基因功能分类工具(https://david.ncifcrf.gov/gene2gene.jsp)，基于功能相似性对筛选出的50种最具有表达差异的基因进行分组。上调组筛选出1个功能相关基因组，基因为SIGLEC8、CNTN6、VSTM2A、VSTM2L。下调组筛选出2个功能相关基因组，其中一个基因组为SLC34A3、SCNN1B、SLC22A8、SLC9A4、SLC12A1，另外一个基因组为AQP2、MUC15、SLC22A8、SLC14A2。检索相关文献，我们发现SIGLEC8表达的增强预测了PRCC病人的不良预后^[10]。另外，MUC15在PRCC中的表达降低^[11]，但是其余大部分基因在PRCC中的作用仍不明确。

2.2 差异表达基因的基因本体分析

利用在线数据库DAVID分析差异表达基因，以P < 0.05作为临界标准。基因本体分析分为3个功能组：分子功能组、生物过程组和细胞成分组。在生物过程组中，上调的基因主要富集于信号转导、免疫反应、炎症反应等，下调基因主要富集于信号转导、细胞黏附等。在细胞成分组中，上调基因主要富集在膜的组成部分、质膜、细胞外区域等，下调基因主要富集于膜的组成部分、质膜等。在分子功能组中，上调基因主要富集于钙离子结合、受体结合等，下调基因主要富集于钙离子结合、蛋白质同源二聚化活性等。其中，PRCC标本转录组上调基因最显著富集的5个基因本体术语见图 2A~C，下调基因最显著富集的5个基因本体术语见图 2D~F。

2.3 信号通路富集分析

使用KEGG PATHWAY在线网站进行差异基因的功能和信号传导途径富集。上调的基因主要富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用、神经活性配体-受体相互作用等，下调的基因主要富集于代谢途径、神经活性配体-受体相互作用、癌症的途径等。见图 2G、H。

2.4 基因集富集分析

基因集富集分析通过关注具有共同生物功能、染色体定位或调节的基因组，从而筛选出可能与疾病表型相关的过量表达的基因或蛋白质。我们使用KEGG基因组作为基因集对PRCC及其癌旁正常组织的转录组数据进行基因集富集分析。确定了7个上调途径以及12个下调途径。见图 3A、B。

3 讨论

在过去的几十年中，已经进行了大量的基础和临床研究，揭示PRCC形成和发展的原因和潜在机制^[12-15]。已报道PRCC具有代表性遗传基因突变和失调的途径包括：MET基因突变、HIPPO途径、NRF2途径、染色质修饰基因突变等^[9]。本研究应用生物信息分析技术深入分析TCGA数据集，并在第一步中确定了4 639个差异表达的基因(2 638个上调和2 001个下调)。在第二步中，对筛选差异表达基因进行基因本体分析及代谢通路分析，本研究中筛选的上调基因主要富集在信号转导、免疫反应、炎症反应、膜的组成部分和钙离子结合等途径中；下调基因主要富集在信号转导、细胞黏附、膜的组成部分和钙离子结合等途径中。改变的基因和信号转导途径为理解PRCC的分子基础提供相关数据，从细胞通路及代谢途径更好揭示PRCC内在分子机制，探究预后的生物标志物及治疗靶点。既往研究已提示上皮细胞黏附及其活化分子在高级别RCC中的过度表达可能是预后的有用标志^[16]。在PRCC发生骨转移病人的组织样本和原代细胞中，检测到钙离子受体表达明显增强^[17-18]。本研究中，同样观察到钙离子结合途径发生明显改变，与有关文献报道相符合。以前研究表明，肿瘤的发生与炎症状态有密切关系^[19]，这与本研究显示免疫反应、炎症反应相关基因集在PRCC上调具有一致性。此外，既往研究发现肿瘤可建立肿瘤内免疫抑制环境，以支持其生长并促进免疫逃避^[20-21]，本研究结果同样显示肿瘤内免疫反应的改变。肿瘤内的代谢物水平的增加可以促进癌症的发生和发展，可导致细胞信号、酶活性或代谢通量的改变^[22]。散发性和家族性2型PRCC检测到增强的有氧糖酵解，并且具有抗氧化反应的细胞表型^[23-24]。

本研究第三步中，利用基因集富集分析方法分析筛选的差异表达基因的代谢途径，结果表明P53信号通路和DNA修复途径在PRCC中上调。DNA损伤的修复在维持基因组完整性方面起着关键作用^[25]。多种常规DNA修复途径的多功能DNA修复中心经常在癌症中被改变^[26]。有研究表明，DNA损伤修复途径中不利等位基因数量的增加，会增加RCC风险^[27]。不过也有证据表明，DNA修复基因多态性可能不会影响RCC的易感性，但可能会导致DNA修复能力的改变，从而影响肿瘤的进展^[28]。肿瘤抑制基因p53是人类癌症中最常见的突变基因，在细胞凋亡、基因组稳定性和抗血管生成中发挥作用，可以介导RCC细胞周期停滞和细胞凋亡^[29]。研究表明，P53阳性表达与RCC病人预后不良和晚期临床病理特征相关，这表明P53是一个潜在有效的治疗靶点^[30]。

综上所述，利用生物信息学分析，我们共筛选了4 639个候选基因，其富集于信号转导、钙离子结合、细胞因子-细胞因子受体相互作用、代谢途径、P53信号通路和DNA修复等途径。这些发现可提高我们对PRCC病因和潜在分子事件的理解，这些候选基因和途径有可能成为PRCC的治疗靶点。