肾细胞癌(RCC)是泌尿系统常见肿瘤，在男性肿瘤中居第9位，在女性肿瘤中居第14位。2018年，RCC占全球新发肿瘤病例的2.2%，死亡率为1.8%，其中80%~90%为肾透明细胞癌(ccRCC)^[1-2]。尽管癌症的检测和治疗取得了很大进展，但ccRCC的总生存率仍然很低。超过1/3的病人在诊断时已经发生转移，Ⅳ期ccRCC的5年标准化相对生存率仅为6%，而Ⅰ期约为84%^[3-4]。因此，研究ccRCC的发生发展机制，寻找新的生物标志物对ccRCC的早期诊断、治疗及预后判断具有重要意义。传统的“单疾病单基因”的研究模式不能从多基因协同角度了解疾病的发生与发展。本研究采用生物信息学的方法，通过加权基因共表达网络分析(WGCNA)，将功能相似的基因归入同一基因模块，探究基因之间的相关性以及基因模块和临床特征之间的关联，筛选枢纽基因，以了解ccRCC发生进展过程中的关键基因及信号通路，为ccRCC治疗寻找新的靶点。

1 材料与方法 1.1 差异表达基因的筛选

从NCBI的GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载编号GSE73731的ccRCC芯片数据集。该数据集基于GLP570平台，包括265例ccRCC组织，其中包括高分化(Furhman Ⅰ/Ⅱ)病例112例，中/低分化病例144例(Furhman Ⅲ/Ⅳ)，未分级者9例。Ⅰ期病人41例，Ⅱ期病人12例，Ⅲ期病人28例，Ⅳ期病人44例，分析数据缺失140例。利用R软件中Bioconductor(http://www.bioconductor.org)内的Affy包^[5]读取原始文件，使用RMA算法预处理得到标准化的基因表达谱数据。剔除离群样本，用R软件的limma包^[6]对基因表达矩阵进行分析，设置校正后P值(FDR)＜0.05和对数化表达变化倍数(|log₂FC|)＞2.0作为筛选表达差异基因的阈值，得到高分化与中/低分化ccRCC组织间的差异表达基因(DEGs)，并绘制热图及火山图。

1.2 基因共表达网络构建

使用R软件的WGCNA包^[7]，通过方差分析筛选方差前25%的基因用于WGCNA。计算各基因间的Pearson相关系数，选择适当的软阈值β使得构建的网络更符合无标度网络的标准。采用一步法构建基因网络，将邻接矩阵转化为拓扑重叠矩阵TOM，利用层次聚类产生一个基因的层次聚类树。计算基因显著性(GS)以及模块显著性(MS)，用以衡量基因与临床信息的显著性，并分析模块及模型的显著关联。

1.3 枢纽基因的筛选

计算各基因模块身份(MM)以衡量基因在模块中的重要性。设置参数为|MM|＞0.9和|GS|＞0.2筛选基因。将枢纽模块中的基因上传至STRING数据库(https://string-db.org/)构建蛋白相互作用网络，选取点度中心性(degree)＞80筛选基因，两者取交集即为枢纽基因。

1.4 枢纽基因的表达与ccRCC分级、分期及预后的关系

使用GSE73731数据对枢纽基因进行线性回归分析，探究基因表达量与ccRCC分级之间的关系，并绘制受试者工作特征(ROC)曲线，计算曲线下面积(AUC)，当AUC＞0.7时，认为该基因对诊断ccRCC进展具有较高的灵敏度和特异度。使用基于TCGA的GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/)和UALCAN数据库(http://ualcan.path.uab.edu/)分析枢纽基因在ccRCC中的表达水平及其与肿瘤分级、分期、预后的关系。

1.5 GO和KEGG富集分析

使用DAVID数据库(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)对特定模块的基因进行GO和KEGG通路分析，以错误发现率(FDR)＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 差异表达基因筛选

使用R软件读取及预处理芯片数据后，共得到20 460个表达谱基因。以FDR＜0.05和|log₂FC|＞5.0为阈值筛选后，得到333个DEGs，其中上调基因152个，下调基因181个。DEGs热图及火山图见图 1。

2.2 基因共表达网络构建

本研究通过方差分析筛选方差前25%的基因共5 115个用于WGCNA。以相关系数等于0.9作为标准，使用pickSoftThreshold函数，选择邻接矩阵权重参数(软阈值)β=6构建基因模块。使用一步法构建共表达矩阵，并利用动态混合剪切法，得到12个基因模块, 其中green模块(包括355个基因)的GS高于其他模块(图 2)。因此，green模块与ccRCC病理分级的相关性最高，与肿瘤进展明显相关。

2.3 枢纽基因的筛选

对green模块基因以|MM|＞0.9和|GS|＞0.2为参数筛选枢纽基因得到10个枢纽基因，将green模块基因上传至STRING数据库以degree＞80为参数筛选枢纽基因得到23个枢纽基因，两者取交集得到CEP55、CCNB1、NUF2、BUB1B、KIF14共5个在共表达网络和蛋白相互作用网络皆重要的枢纽基因(表 1)。

2.4 枢纽基因的表达与ccRCC分级、分期及预后的关系

使用GSE73731数据集进行线性回归分析，结果显示各枢纽基因与ccRCC组织学分级呈正相关(t=17.53~25.18, P < 0.01)。见图 3A~E。ROC曲线分析，BUB1B基因对ccRCC组织学分级具有较高诊断效能(AUC=0.706，P＜0.01)，而CEP55、CCNB1、NUF2、KIF14对ccRCC组织学分级诊断效能较弱(AUC=0.680~0.691，P＜0.01)。见图 3F~J。基于TCGA的UALCAN和GEPIA数据库验证结果显示，5个枢纽基因的表达水平在肿瘤组织中均明显升高(FC=1.76~7.13，P＜0.01)，且与肿瘤的分级及分期明显相关。见图 4。预后结果显示，CEP55、NUF2、BUB1B与肿瘤的总生存期(OS)明显相关(HR=1.5~1.9，P＜0.01)。见图 5A~E。CEP55、CCNB1、BUB1B、KIF14与肿瘤的无病生存期(DFS)明显相关(HR=1.6~1.7，P＜0.01)。见图 5F~J。

2.5 GO和KEGG富集分析

为了了解枢纽模块的可能功能，对green模块中的基因进行了GO和KEGG富集分析。GO富集分析显示，模块基因主要富集在细胞周期、细胞器分裂、核分裂等生物学过程；KEGG富集分析显示，模块基因主要富集在细胞周期通路上。见图 6。

3 讨论

本研究利用生物信息学方法，通过对ccRCC芯片数据集GSE73731进行分析，筛选得到表达上调基因152个，表达下调基因181个。通过WGCNA，将表达模式相似的基因进行聚类，并分析模块与特定性状或表型之间关联。结果显示，green模块与ccRCC病理分级的相关性最高，green模块内基因集与肿瘤的进展与预后密切相关。为进一步筛选在ccRCC进展过程中的关键基因，将green模块中进一步筛选出的基因与蛋白相互作用网络筛选出的基因交集，筛选出CEP55、CCNB1、NUF2、BUB1B、KIF14共5个枢纽基因。对GSE73731数据集进行线性回归分析，结果显示各枢纽基因与ccRCC组织学分级密切相关，且BUB1B基因具有较高的诊断价值，说明其能够区分不同病理分级的ccRCC。使用TCGA数据进行独立的外部验证，各枢纽基因的表达水平在肿瘤组织中均明显升高，且与肿瘤的分级及分期明显相关，说明其在ccRCC发生及进展过程中起关键作用。本文预后结果显示，CEP55、BUB1B基因与肿瘤的OS及DFS明显相关，提示CEP55和BUB1B基因对ccRCC病人的预后具有一定的预测价值。

CEP55基因编码一种中心体相关蛋白，在中间体依赖性的细胞功能如中心体复制、细胞周期及胞质分裂的调节中发挥重要作用^[8]。有研究表明，在肝细胞肝癌、肺腺癌、卵巢癌、结肠癌、乳癌等肿瘤中，CEP55高表达与肿瘤的高恶性程度、高侵袭性以及不良预后相关^[9-10]。CCNB1编码细胞周期蛋白B1，是细胞周期G₂/M期的重要调控因子，在非小细胞肺癌、外阴鳞状细胞癌、结直肠癌中对肿瘤病人的抗药性、局部或远处转移、复发、生存等指标具有良好的预测价值^[11-13]。细胞分裂相关基因NUF2编码的蛋白，作为NDC80复合体的重要组成部分之一，在动粒-微管黏附中扮演重要角色，在有丝分裂和肿瘤发生发展中起着重要作用^[14-16]。BUB1B为纺锤体检测点蛋白，作为有丝分裂检测点的重要功能蛋白，调节细胞周期及有丝分裂。BUB1B在肾癌及乳癌等多种肿瘤中过表达，且其突变及过表达与染色体不稳定性、细胞分化和衰老相关，可促进肿瘤的发生及进展^[17-18]。KIF4作为驱动蛋白超家族中的成员，可调节纺锤体的形成、染色体的分离和胞质分裂，其表达异常可引起染色体分离失败和胞质分裂不完全，从而引起细胞异常、增殖和分化，诱发肿瘤形成，其异常表达已经在多种恶性肿瘤中得到证实^[19-21]。

本研究对枢纽模块基因进行GO和KEGG富集分析，结果显示，模块基因主要富集在细胞周期等相关生物学过程及通路上。在真核生物中，细胞周期主要受细胞周期蛋白(Cyclin)、细胞周期蛋白依赖激酶(CDK)以及细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂(CKI)所构成的Cyclin-CDK-CKI信号网络精准调节。具有明显周期性表达的Cyclin可以与不同的CDK结合成复合物，并激活CDK的激酶活性，从而在不同时相对细胞周期进行调控。而CKI对CDK具有抑制作用。Cyclin-CDK-CKI信号网络对细胞周期的调控主要通过Rb途径和p53途径。在Rb途径中，生长因子与细胞表面受体如fos/jun/myc结合，可促进Cyclin表达并形成Cyclin-CDK复合物，磷酸化Rb蛋白后，Rb-E2F复合物释放E2F进入细胞核，促进下游DNA表达。而CKI可以抑制Cyclin-CDK活性，使得Rb去磷酸化，阻滞细胞周期进展。在p53通路中，DNA受损后，p53可结合到p21基因启动子区，激活p21转录。P21作为重要的CKI，可抑制CDK活性，可阻滞细胞从G₁期进入S期^{[11-12, 22]}。

CCNB1是细胞周期中G₂/M转换的关键因子，可进入细胞核内，与CDK1结合形成CCNB1-CDK1复合物，通过Rb途径诱导细胞进入M期。当细胞退出M期时，CCNB1降解，CDK1激酶活性丧失，细胞进入下一周期^[22]。一项针对骨肉瘤的研究表明，CEP55的表达水平与CCND1呈正相关，敲低CEP55表达导致CCND1表达水平降低。CCND1可与CDK4/CDK6形成复合物，调控G₁期到S期的转换^[23-24]。一项针对肝细胞肝癌的研究表明，敲低NUF2表达可导致CCNB1、Cdc25A、Cdc2等蛋白表达水平降低，诱导细胞周期停滞在G₀/G₁期，说明NUF2也可以通过Rb通路调控细胞周期^[25]。一项针对多发性骨髓瘤的研究表明，BUB1B可通过介导CDC20/CCNB轴促进细胞增殖，在肿瘤进展中起重要作用^[26]。有研究表明，KIF14敲低可下调Skp2和Cks1的表达，进而抑制蛋白酶体依赖性p27Kip1泛素化，p27Kip1的增加抑制细胞周期蛋白的表达，包括CCNB1、CCND1和CCNE1，从而抑制肿瘤发生及进展^{[25, 27-28]}。因此，CEP55、CCNB1、NUF2、BUB1B、KIF14等5个枢纽基因可能通过细胞周期相关通路，尤其是Rb通路，来影响ccRCC的发生、进展及预后。

综上所述，本研究通过构建基因共表达网络，筛选出与ccRCC进展相关的5个枢纽基因，这5个基因与肿瘤的分期、分级及预后密切相关；枢纽基因可能通过细胞周期相关通路来影响ccRCC的发生、进展及预后^[1]。