2019, Vol. 55
2. 青岛大学附属医院心内科, 山东 青岛 266021
神经胶质瘤是大脑中最常见的原发性肿瘤，占所有恶性脑肿瘤的80%[1]。目前，综合疗法已被广泛用于治疗神经胶质瘤，但是疗效不佳，病人存活率较低，所以需要进一步探究神经胶质瘤发生和发展的调节机制，寻找潜在的治疗靶点。有文献报道，成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)在神经胶质瘤细胞中高表达，而且FGFR1是酪氨酸蛋白激酶(Src)的上游调节因子，可以激活Src通路[2]。PP2是Src家族激酶信号通路的抑制剂，可以通过调节不同类型细胞的迁移和增殖来调节各种疾病[3-5]。然而，PP2在神经胶质瘤细胞中的作用尚不清楚。本研究旨在探讨PP2对C6神经胶质瘤细胞增殖和迁移的影响及其分子机制。
1 材料和方法 1.1 主要材料PP2购自美国Selleckchem公司；成纤维细胞生长因子2(FGF2)购自美国Peprotech公司；胎牛血清(FBS)购自美国ExCell Bio公司；DMEM培养液购自美国Gibco公司；EdU试剂盒购自美国RiboBio公司；Transwell小室购自BD Biosciences公司；MTT试剂盒购自Sigma公司；RIPA缓冲液购自北京索莱宝公司；磷酸化Src(p-Src)、FGFR1、磷酸化FGFR1(p-FGFR1)、P65、c-jun、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、磷酸化细胞外调节激酶(p-ERK)、磷酸化信号转导和转录激活因子1(p-STAT1)一抗及二抗购自美国Cell Signaling Technology公司。
1.2 细胞培养C6大鼠神经胶质瘤细胞购上海中国科学院细胞库，用含体积分数0.10 BSA的DMEM培养液在培养箱(37 ℃，含体积分数0.05 CO2)中培养。
1.3 细胞存活率测定将C6神经胶质瘤细胞以每孔108/L的密度接种于96孔板，37 ℃培养12 h后，分别用0、0.002 5、0.005 0、0.010 0、0.030 0、0.040 0 mol/L的PP2进行处理(均设3个平行复孔)。分别在孵育48、72和96 h时，按MTT试剂盒说明书，使用酶标仪(Biohit，Helsinki，Finland)在595 nm波长处检测吸光度(A)值。实验重复3次。
1.4 EdU实验检测细胞增殖将C6神经胶质瘤细胞以每孔108/L的密度接种于96孔板，37 ℃培养12 h。将细胞分为空白对照组(A组)、50 μg/L FGF2处理组(简称FGF2处理组，B组)、50 μg/L FGF2和0.02 mol/L PP2共处理组(简称共处理组，C组)，并进行相应处理。处理24 h后，根据EdU试剂盒说明书对细胞进行染色，使用荧光显微镜(Zeiss，LSM510，META)拍照并用图像处理工具ImageJ v1.8.0分析数据。实验重复3次。
1.5 Transwell小室实验检测细胞迁移将200 μL含有2.5×108/L细胞的无血清细胞悬液接种于Transwell小室的上室，下室加500 μL含体积分数0.10 FBS的DMEM培养液。将细胞按1.4所述进行分组并处理。处理后24 h，弃上清，用磷酸盐缓冲液湿润的棉棒轻轻擦去残留在膜上侧的细胞。然后用40 g/L多聚甲醛固定细胞30 min，在室温下用1 g/L结晶紫染色30 min。使用荧光显微镜(Zeiss，LSM510，META)拍照，选择5个随机区域来计数细胞。实验重复3次。
1.6 蛋白质印迹方法检测Src通路相关蛋白表达取含有108/L C6神经胶质瘤细胞的细胞悬液2 mL接种于6孔板中，将细胞按1.4所述进行分组并处理，在处理后5、10、20、30、60 min时快速收集细胞。将收集的细胞沉淀置于含有0.1 mmo/L苯基甲基磺酰氟和10 g/L蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液中，在冰上裂解10 min，4 ℃温度下以12 000 r/min离心15 min。采用蛋白质印迹方法[6]检测FGFR1、p-FGFR1、p-Src、p-Akt、p-ERK和p-STAT1蛋白的表达水平。实验重复3次。
1.7 蛋白质印迹方法检测核蛋白表达将神经胶质瘤细胞按照1.4所述进行分组并处理，快速收集细胞，将其重悬于300 μL细胞裂解缓冲液中，在冰上裂解30 min，4 ℃下以1 000 r/min离心20 min。将收集的细胞沉淀重悬于200 μL核裂解缓冲液中，在冰上裂解30 min(每5 min振荡1次)。4 ℃下以12 000 r/min离心10 min，所得上清即为核蛋白。采用蛋白质印迹方法[6]检测核蛋白P65、c-jun的表达水平。实验重复3次。
1.8 统计学处理使用GraphPad Prism 5软件进行统计学处理，计量资料数据以x±s表示，多组比较采用one way ANOVA检验，组间两两比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 PP2对神经胶质瘤细胞存活率的影响在相同处理时间，C6神经胶质瘤细胞存活率随着PP2浓度的升高而降低；相同浓度PP2处理，C6神经胶质瘤细胞存活率随着处理时间延长而降低，差异均有统计学意义(F=10.25~56.18，P＜0.05、0.01)。见图 1。
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| 注：*P < 0.05，** P < 0.01。 图 1 MTT检测各组细胞的存活率 |
EdU实验结果显示，FGF2处理组细胞增殖率较空白对照组明显增加，而共处理组细胞增殖率较FGF2处理组明显降低，差异具有统计学意义(F=32.23，P＜0.01)。见表 1。
| 表 1 PP2对C6神经胶质瘤细胞增殖和迁移的影响(n=3, x±s) ‘ |
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Transwell实验结果显示，FGF2处理组细胞迁移数量较空白对照组明显增加，而共处理组细胞迁移数量较FGF2处理组明显降低，差异具有统计学意义(F=22.15，P＜0.01)。见表 1。
2.4 PP2对神经胶质瘤细胞中Src通路相关蛋白表达的影响空白对照组、FGF2处理组和共处理组细胞p-FGFR1/FGFR1分别为0、0.632±0.029和0.133±0.015，FGF2处理组较空白对照组明显升高，而共处理组较FGF2处理组明显降低，差异具有统计学意义(F=20.21，P＜0.05)。在药物处理5 min时，共处理组p-Src、p-AKT、p-ERK和p-STAT1蛋白表达水平较FGF2处理组均降低；药物处理10 min时，共处理组p-AKT、p-ERK和p-STAT1蛋白表达水平较FGF2处理组升高；药物处理30、60 min时，共处理组p-AKT、p-ERK和p-STAT1蛋白表达水平较FGF2处理组降低，差异均具有显著性(F=15.33~156.38，P＜0.05、0.01)。见表 2。
| 表 2 各组Src通路相关蛋白表达的比较(n=3, x±s) |
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在相同处理时间，与FGF2处理组相比，共处理组细胞P65和c-jun蛋白表达水平降低，差异具有显著意义(F=10.17~278.11，P＜0.05、0.01)。在不同处理时间中，以药物处理60 min时FGF2处理组与共处理组P65和c-jun蛋白表达水平差异最明显。见表 3。
| 表 3 各组P65和c-jun蛋白表达的比较(n=3, x±s) |
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神经胶质瘤没有明显的边界，难以完整手术切除。化疗和放疗对神经胶质瘤细胞的特异性低而且具有许多副作用和明显的毒性反应，治疗效果较差。但目前化疗仍是最常用的治疗方法[1, 7]。传统抗癌药物(如替莫唑胺、洛莫司汀和替尼泊苷)存在很多缺点，如选择性差、副作用严重、血-脑脊液屏障穿越等[8-9]。因此，神经胶质瘤的治疗迫切需要基于分子生物学和基因疗法的新型治疗策略。
文献报道，FGFRs属于跨膜受体酪氨酸蛋白激酶，包括FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4[10]。其中，FGFR1是αFGF、βFGF和FGF5的高亲和力受体[11]。FGFs/FGFRs的异常诱导和持续活化可导致神经胶质瘤等多种肿瘤的发生[9, 12-13]。有研究表明，FGFR1在C6神经胶质瘤细胞中高表达[2]。在病理状态下神经胶质瘤细胞FGFR1的磷酸化水平较高，FGF2刺激也可以使C6神经胶质瘤细胞中p-FGFR1水平升高[3, 14]。因此，本研究用50 μg/L FGF2刺激C6神经胶质瘤细胞模拟病理条件。作为受体酪氨酸激酶，FGFR1包含细胞外配体结合结构域、单个跨膜区和蛋白酪氨酸激酶核。FGFR1与配体结合后其酪氨酸残基会快速自磷酸化，活化的蛋白激酶和转录因子进入细胞核会调节细胞周期和细胞转化，从而促进细胞增殖[15]。同时，FGFR1还是Src蛋白的上游调节因子，可以激活Src通路，故抑制FGFR1磷酸化可以阻止Src活化。而激活的Src可以调节多条信号途径，包括丝裂原活化蛋白激酶、PI3K/Akt、STAT和PLC途径[15-17]。本研究结果表明，PP2可显著影响Src信号通路相关蛋白(包括p-ERK、p-AKT和p-STAT1)的表达，且Src通路相关蛋白的磷酸化水平随着PP2作用时间的延长而发生变化，这符合信号通路调控的时间规律。有研究表明，FGF2刺激后，一些重要的核转录因子如NF-κB和AP-1蛋白可以转移到细胞核中[18]。文献报道，核内转录因子P65和c-jun是调节Src信号通路的重要转录因子[9]。本文研究结果显示，与FGF2处理组相比，共处理组细胞P65和c-jun蛋白表达水平降低，差异具有统计学意义，表明PP2可能是通过靶向FGFR1调节P65和c-jun信号传导途径而表现出抗癌作用。目前，一些通过激活替代信号传导途径，或者通过靶向细胞内酪氨酸激酶结构域的ATP结合位点来抑制FGFR的药物已经被开发应用，例如普纳替尼、瑞格非尼、帕唑帕尼、尼达尼布和乐伐替尼等已被美国食品和药物管理局批准用于治疗癌症[19-21]。然而，这些药物有较多的副作用，说明上述靶向抑制药物仍然存在一些问题，需要进行更深入的研究。基于此背景，应该尽快将PP2抑制剂的研究推向动物水平研究。
总之，本文结果表明，PP2可通过靶向FGFR1和Src发挥抗肿瘤作用，这可能为研发神经胶质瘤的新型治疗药物提供一个新思路。
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