骨肉瘤好发于青少年人群，恶性程度高，可早期发生转移，复发率较高，预后多不良^[1]，严重威胁病人生存健康。近年来，虽然临床诊疗水平不断进步，但骨肉瘤病人复发率和5年生存率并未得到明显改善^[2]。有研究指出，骨肉瘤细胞增殖、分化、侵袭、转移能力强是影响肿瘤预后的主要因素^[3]。但目前影响骨肉瘤细胞增殖、侵袭、转移的机制尚未完全清楚。Polo样激酶1(PLK1)是PLK家族重要成员，是一种高度保守的丝/苏氨酸蛋白激酶，在细胞分裂、DNA损伤修复中发挥重要作用^[4]。有研究指出，PLK1在多种恶性肿瘤中呈高表达，参与了肿瘤发生、进展过程^[5]。本研究利用小分子干扰RNA(siRNA)技术特异性沉默人骨肉瘤MG-63细胞系中的PLK1基因，观察其对细胞生物学特性的影响，以期为骨肉瘤机制研究及临床诊治提供基础资料。现将结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 主要材料

人骨肉瘤MG-63细胞系购自美国ATCC公司，RPMI-1640培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司，Trizol总RNA提取试剂盒购自北京百泰克生物技术公司，Lipofectamine2000转染试剂购自北京方程佰金科技公司，逆转录和PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司，PLK1及内参引物由上海生工生物公司设计合成，siRNA-PLK1、siRNA-对照序列由上海吉玛制药技术公司设计合成，Transwell小室购自美国Millipore公司，兔抗人PLK1多克隆抗体购自美国Calbiochem公司，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、流式细胞仪购自美国BD公司，凝胶电泳分析系统购自美国Bio-rad公司。

1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养及分组

MG-63细胞加含体积分数0.10胎牛血清的RPMI-1640培养液，置于含体积分数0.05 CO₂、37 ℃恒温培养箱中培养。待细胞融合度达到80%左右时传代。取对数生长期的细胞进行转染^[6]，并将细胞分为以下3组。①空白组(A组)：不作任何处理；②siRNA-对照序列组(B组)：转染对照序列5′-AAUUUGGCCGGGCCGU- GCG-3′；③siRNA-PLK1组(C组)：转染PLK1基因的siRNA序列5′-AAGGGCGGCUUUGCCAA- GUGC-3′。各组转染完成后继续恒温培养24 h，完成后续实验。

1.2.2 实时荧光定量PCR技术检测细胞中PLK1基因表达

取各组转染后培养48 h的细胞，胰酶消化后，用裂解液裂解，按Trizol总RNA提取试剂盒说明提取总RNA，并检测纯度和浓度，将其反转录为cDNA，以cDNA为模板行PCR。PLK1及内参引物序列见表 1。PCR反应条件为：95 ℃、3 min，95 ℃、40 s，58 ℃、40 s，70 ℃、40 s，循环36次。每个样本均设6个平行复孔。用2^-△△Ct法计算各组细胞中PLK1 mRNA相对表达量^[7]。

1.2.3 Western blot法检测细胞中PLK1蛋白的表达

取各组转染后培养48 h的细胞，胰酶消化后用裂解液裂解，提取细胞中总蛋白，用BCA总蛋白检测试剂盒检测蛋白纯度和浓度。取30 μg总蛋白，行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转至PVDF膜，室温下用含50 g/L脱脂奶粉的TBST封闭60 min，加入一抗兔抗人PLK1多克隆抗体(稀释比例1:1 000)，4 ℃过夜孵育，TBST洗膜3次，加入二抗，室温下孵育120 min，TBST洗膜3次，加入ECL避光反应25 min，拍照，应用Image J图像分析软件对灰度值进行定量分析，获得各组细胞中PLK1蛋白相对表达量^[8]。

1.2.4 CCK-8法检测细胞增殖活性

取各组转染后培养48 h的细胞，消化后接种于96孔板中，将细胞密度调整为每孔2×10⁴个，置于含体积分数0.05 CO₂的37 ℃恒温培养箱中培养。分别于培养24、48、72和96 h时，将孔板中的培养液去除，加入100 μL的无血清培养液和10 μL的CCK-8溶液，空白组仅加入无血清培养液，继续37 ℃恒温孵育120 min。用酶标仪在490 nm波长处检测各孔吸光度(A)值^[9]。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡

取各组转染后培养48 h的细胞，胰酶消化后收集细胞，用4 ℃预冷的PBS洗涤3次，用1×缓冲液重悬细胞，调整细胞密度为1×10⁹/L，取100 μL细胞悬液加入流式管中，再分别加入5 μL的Annexin V-FITC和PI，摇匀，室温下在暗室中孵育20 min，60 min内上机检测^[10]。

1.2.6 Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力

迁移能力检测：取各组转染后培养48 h的细胞，消化，离心，用无血清培养液重悬细胞并计数，取2×10⁴个细胞加入小室上室，将含体积分数0.20胎牛血清的RPMI-1640培养液600 μL加入下室，培养24 h，甲醛固定，10 g/L结晶紫染色，将散落的细胞用棉签轻轻去除，以PBS冲洗3次，拍照，于高倍镜下随机取5个视野计数穿膜细胞数^[11-12]。侵袭能力检测：取50 μL的Matrigel胶平铺于Transwell小室内侧，风干后备用；其余步骤同迁移能力检测。

1.3 统计学分析

使用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析和LSD-t检验，重复测量资料的比较采用重复测量方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 PLK1在各组细胞中的表达

与空白组和siRNA-对照序列组比较，siRNA-PLK1组细胞中PLK1 mRNA和蛋白相对表达量均降低，差异有统计学意义(F=129.125、62.363，P＜0.01)。见表 2和图 1。

2.2 各组细胞增殖活性比较

与空白组和siRNA-对照序列组比较，siRNA-PLK1组细胞培养48、72和96 h时的A值均降低，差异有统计学意义(F_组间=32.021，F_时间=357.249，F_交互=5.755，P＜0.01)。见表 3。

2.3 各组细胞凋亡率比较

siRNA-PLK1组、siRNA-对照序列组和空白组细胞凋亡率分别为(6.7±2.2)%、(6.5±0.9)%和(14.9±1.4)%，与空白组和siRNA-对照序列组比较，siRNA-PLK1组细胞凋亡率升高，差异有统计学意义(F=69.863，P＜0.01)。

2.4 各组细胞迁移和侵袭能力比较

siRNA-PLK1组迁移细胞数和侵袭细胞数均低于空白组和siRNA-对照序列组，差异有统计学意义(F=28.998、34.783，P＜0.01)。见表 4。

3 讨论

骨肉瘤作为严重威胁青少年健康的常见恶性肿瘤，具有较强的侵袭、转移能力，约20%的病人在临床确诊时已出现肺转移，约50%的病人在治疗过程中发生肺转移^[13-15]。目前，骨肉瘤病人整体治疗效果仍不佳，多数病人预后不良，5年生存率尚不足30%^[16]。细胞异常增殖和侵袭是骨肉瘤发生远处转移及治疗失败的主要原因^[17-18]。PLK1作为丝/苏氨酸激酶家族成员，在调控细胞周期、促进有丝分裂及胞质分裂中发挥关键性作用^[19-20]。研究表明，多数恶性肿瘤组织中PLK1呈高表达，且与病人预后有关^[21-23]。抑制或敲除PLK1基因可促进肿瘤细胞凋亡，增加其对化疗药物的敏感性，且不会对正常细胞产生影响^[24]。有研究表明，PLK1抑制剂可抑制骨肉瘤细胞的增殖，且PLK1蛋白水平的高表达与病人不良预后密切相关^[25]。

本研究利用siRNA技术特异性下调骨肉瘤细胞中PLK1表达，结果显示，siRNA-PLK1组细胞中PLK1 mRNA和蛋白相对表达量均显著降低，表明PLK1基因表达被抑制。进一步的实验结果显示，siRNA-PLK1组细胞培养48、72和96 h时的A值均较siRNA-对照序列组和空白组明显降低，说明特异性抑制PLK1基因表达可有效抑制骨肉瘤细胞增殖，这与以往的有关研究结论相一致^[26]。刘晓影等^[27]通过建立食管鳞癌细胞裸鼠移植瘤研究显示，下调PLK1表达可抑制移植瘤的生长。本研究结果显示，特异性抑制骨肉瘤细胞中PLK1基因表达后，骨肉瘤细胞凋亡率显著增加，说明抑制PLK1基因表达可促进骨肉瘤细胞凋亡。毛永欢等^[28]的研究结果亦表明，靶向沉默PLK1基因可促进胰腺癌细胞凋亡。有研究表明，PLK1基因与细胞分裂关系密切，在肝癌等实体肿瘤细胞侵袭、迁移中发挥重要作用^[29]。丁克云等^[30]研究表明，干扰PLK1表达可抑制恶性黑素瘤细胞的侵袭，其机制可能与诱导失巢凋亡有关。本研究结果显示，siRNA-PLK1组迁移细胞数和侵袭细胞数较siRNA-对照序列组和空白组均减少，说明PLK1基因表达与骨肉瘤细胞迁移、侵袭能力有关，提示PLK1基因可能参与了骨肉瘤细胞侵袭、迁移过程，并在此过程中发挥重要作用。

综上所述，沉默PLK1基因表达可抑制骨肉瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡，并且可抑制骨肉瘤细胞迁移、侵袭能力，有望为骨肉瘤临床诊疗提供新的靶位。下一步我们将从分子生物学角度更加深入探讨PLK1在骨肉瘤发生及进展中的作用机制。