2019, Vol. 55
2. 单县中心医院创伤外科
骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有多向分化潜能[1-3]，可以分化成骨细胞、软骨细胞以及神经细胞等[4-7]。新近研究表明，BMSCs可以在特定诱导条件下转化成软骨细胞，进而促进骨与软骨损伤的修复，而且BMSCs来源于病人自体，移植后可以避免排斥反应，这为临床上软骨缺损的修复提供了一个新的思路[8-10]。胰岛素样生长因子-1(IGF-1)是一类光谱性促生长因子，其结构与胰岛素原类似，可以促进细胞和组织生长[11-13]。既往研究表明，IGF-1与骨密度有关，其表达量增多时，骨密度也相应增加，IGF-1对临床老年性骨质疏松具有明显的治疗效果[14-15]。也有研究结果表明，组织工程材料纤维多孔支架可以促进软骨缺损的修复[16-17]。然而尚未有相关研究以BMSCs为种子细胞，用IGF-1基因过表达质粒转染BMSCs，并结合Gelatin/PLA纳米纤维多孔支架构建组织工程支架。本研究通过制备Gelatin/PLA纳米纤维多孔支架，体外培养兔来源的BMSCs，构建细胞和支架的联合培养体系，观察IGF-1过表达质粒转染BMSCs联合纳米纤维多孔支架对兔软骨缺损的修复效果，以期为临床上软骨缺损的治疗提供思路与方法。
1 材料与方法 1.1 实验材料新西兰大白兔购自济南朋悦实验动物繁育有限公司；DMEM、TRIZOL及2.5 g/L胰蛋白酶Trypsin购自美国Invitrogen公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；逆转录试剂盒购自美国ABI Applied Biosystems公司；Real-time PCR仪购自美国Bio-rad公司。
1.2 实验方法 1.2.1 兔来源BMSCs的分离和培养新西兰大白兔以利多卡因20 mL局部麻醉，利用骨穿穿刺针提取新鲜骨髓，按1:3体积比加入含体积分数0.01胎牛血清、105 U/L青霉素的DMEM细胞培养液，充分混匀后，移入25 cm2的Hank培养瓶中，以差速培养法培养，3 d后去掉培养瓶中的油脂等杂质，之后每3 d换1次细胞培养液。BMSCs细胞融合率达70%~80%后进行传代培养。
1.2.2 BMSCs的鉴定采用倒置光学显微镜观察BMSCs的细胞形态；采用流式细胞仪检测BMSCs CD29、CD44、CD71、CD90和CD106等表面蛋白的表达。
1.2.3 慢病毒IGF-1过表达载体的构建慢病毒IGF-1过表达载体是由上海吉凯基因公司合成，以pHBLV-U6-ZsGreen-PGK-Puro作为质粒的克隆载体。慢病毒IGF-1过表达载体克隆切入点是XhoI/BamHI，并经基因测序证明序列的正确性。
1.2.4 慢病毒细胞转染取第2代BMSCs，将其接种到6孔板，待细胞融合率达50%时根据转染说明书进行慢病毒转染，MOI=50，慢病毒滴度为3×107 mg/L。
1.2.5 Gelatin/PLA三维支架的制备和检测将10 g明胶粉末溶解于8 mL六氟异丙醇中，用玻璃棒搅拌至充分溶解。加入3 mL的PLA溶液，制备PLA质量分数为0.20的Gelatin/PLA支架材料，采用无纺布作为接收装置，利用静电纺技术制备Gelatin/PLA纳米纤维膜。将3 g纳米纤维膜打碎，加入100 mL叔丁醇溶液中，用冷冻干燥机完全冷冻后得到Gelatin/PLA三维支架。应用扫描电镜对丝蛋白支架结构以及细胞共培养体系(包括纳米纤维多孔支架+转染IGF-1过表达载体BMSCs复合物、纳米纤维多孔支架+未转染BMSCs复合物)进行观察。
1.2.6 动物分组及膝关节软骨缺损模型构建取15只成年健康新西兰大白兔，随机分为3组，每组5只。以150 g/L水合氯醛3 mL/kg静脉内麻醉兔，常规皮肤消毒、铺无菌单，取膝关节正中侧切口，长约2 cm，逐层切开皮肤、皮下软组织、浅深筋膜，显露膝关节，使用口腔钻在兔股骨侧软骨钻孔制成软骨缺损(长5 mm、宽2 mm、深3 mm的锥形软骨缺损)，生理盐水冲洗后，实验组和对照组分别用纳米纤维多孔支架+转染IGF-1过表达载体BMSCs复合物和纳米纤维多孔支架+未转染BMSCs复合物填满缺损部位(约100 mg)，模型组以生理盐水代替，逐层缝合。
1.2.7 软骨缺损部位组织苏木精-伊红染色术后14 d切取各组兔软骨缺损部位组织，以40 g/L多聚甲醛固定，行脱钙、系列二甲苯、梯度乙醇处理，自来水冲洗，苏木精-伊红染色，封片，在倒置光学显微镜下观察。
1.2.8 软骨缺损部位组织Aggrecan和Ⅱ型胶原表达检测采用免疫组化SP法。软骨缺损部位组织切片、脱蜡，以PBS冲洗3次，每次5 min；切片室温放置30 min，以PBS冲洗3次，每次5 min；用BSA室温处理10 min，加Aggrecan和Ⅱ型胶原一抗(Novus Biologicals，Littleton，美国)4 ℃过夜，以PBS冲洗3次，每次5 min；加辣根酶标记链酶卵白素液孵育10 min，以PBS冲洗3次，每次5 min；加入AlexaFouor 488羊抗兔IgG二抗(Novus Biolo- gicals，Littleton，美国)室温孵育20 min，以PBS洗3次，每次5 min；DAB显色4 min，再以苏木精复染2 min，倒置光学显微镜下观察。应用Image J软件分析染色强度。
1.3 统计学方法应用SPSS 16.0软件进行统计学分析，所得计量资料数据以x±s形式表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 BMSCs的培养和鉴定接种48 h后，原代BMSCs开始贴壁，细胞呈梭形或者多角形；培养至第2代后，细胞增殖迅速，呈旋涡状或者辐射状生长。流式细胞仪检测第2代细胞的表面蛋白CD29、CD34、CD45和CD90的表达率分别为92.60%、4.24%、3.09%和89.30%。
2.2 支架结构及联合培养体系的扫描电镜观察Gelatin/PLA三维支架纳米膜表面结构空隙较大，有利于细胞黏附；支架表面粗糙，凹凸不平，有利于细胞的黏附和迁移。实验组表面黏附的细胞数较对照组明显增多。
2.3 兔软骨缺损部位组织的病理学观察术后14 d，大体观察显示，实验组兔软骨缺损部位有明显的填充物，对照组兔软骨缺损部位的填充物明显少于实验组，而模型组兔软骨缺损几乎没有修复。软骨缺损部位组织苏木精-伊红染色显示，对照组细胞结构少，支架略有降解，软骨缺损多为纤维性修复；实验组细胞深染，BMSCs向软骨细胞转化较多，软骨缺损多为细胞性修复。
2.4 兔软骨缺损部位组织的免疫组化染色模型组修复软骨组织中细胞棕色染色较浅，对照组细胞棕色染色较深，实验组细胞棕色染色更深。半定量分析结果显示，对照组修复软骨组织中Aggrecan和Ⅱ型胶原表达量明显高于模型组，实验组二者表达量明显高于对照组，差异均有统计学意义(F=15.342、18.928，P＜0.05)。见表 1。
| 表 1 各组兔软骨缺损部位组织Aggrecan和Ⅱ型胶原表达(n=3，x±s) |
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本实验充分利用基因工程和组织工程技术的优势，应用静电纺法制备天然活性多孔Gelatin/PLA三维支架，体外培养兔来源的BMSCs，构建纳米纤维多孔支架和BMSCs的联合培养体系，观察IGF-1过表达质粒转染BMSCs联合纳米纤维多孔支架对兔软骨缺损的修复效果，以期为临床上软骨缺损的治疗提供思路与方法。
IGF-1是一种在分子结构上与胰岛素类似的多肽蛋白物质，因其结构与胰岛素类似而得名[18-19]。邬波等[20]的研究结果表明，IGF-1可以促进BMSCs向软骨细胞的分化。另有研究表明，IGF-1除了可以促进BMSCs向软骨细胞的分化之外，还可以促进脂肪干细胞向软骨细胞的分化[21]。故本研究选择IGF-1过表达的BMSCs作为种子细胞。既往的研究结果表明，BMSCs复合异种骨基质明胶可以促进BMSCs向骨细胞转化，有效修复大鼠桡骨缺损[22-24]。但是这种方法需要符合特定条件的组织工程支架，也就是需要特殊的“土壤”，BMSCs这个“种子”才能更好地在其内生长并且分化，其临床应用的安全性有待调查[25-26]。有学者研究表明，利用慢病毒构建基因载体，转染BMSCs后并不影响BMSCs的表型[27]。可见利用基因工程原理，构建基因过表达的BMSCs也是促进“种子”有效分化的一种手段。本研究正是立足于这一点，构建转染慢病毒介导IGF-1过表达质粒的BMSCs，制作新型“基因种子”，为软骨缺损的临床研究做准备。
有研究表明，抗生素/β-磷酸三钙多孔三维支架可以用于修复兔桡骨骨缺损[28]。本研究采用的多孔Gelatin/PLA三维支架具有良好的生物相容性和抗菌性，扫描电镜观察显示，该支架表面凹凸不平，可以为BMSCs提供良好的黏附部位。这与新近的研究结果相似[29]，证明了研究设计方案的可行性。本研究还观察到，BMSCs不仅可以很好地黏附在Gelatin/PLA三维支架表面，而且可以分泌细胞外基质，填充支架间孔，为临床上软骨缺损治疗提供良好的自体来源的细胞基质。转染IGF-1过表达载体后，BMSCs分泌的细胞外基质更多。本研究体外实验结果表明，转染IGF-1过表达载体后，BMSCs向软骨细胞分化的效率明显提高。体内实验结果也表明，实验组BMSCs向软骨细胞转化效率较高，软骨缺损可以实现真正的“细胞修复”，而不是平常支架所达到的“纤维修复”。可见，Gelatin/PLA三维支架联合IGF-1过表达载体转染BMSCs可以更好地发挥修复作用。另外，本研究还检测了修复软骨组织中Aggrecan和Ⅱ型胶原的表达，结果表明，Gelatin/PLA三维支架+转染IGF-1过表达载体BMSCs复合物可以促进Aggrecan和Ⅱ型胶原的表达，从而更多地合成细胞外基质，从细胞和细胞外基质两个层面对软骨进行修复。
综上所述，Gelatin/PLA三维支架+转染IGF-1过表达载体BMSCs复合物可以促进BMSCs向软骨细胞的分化，并且分泌更多的含Aggrecan和Ⅱ型胶原成分的细胞外基质，从而发挥促进软骨缺损修复的作用。
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