2019, Vol. 55
2. 临沂市中心医院骨科
骨肉瘤多见于年轻人，尤其是20岁以下的青少年和儿童。其恶性程度较高，预后较差[1-2]。目前，临床上针对骨肉瘤的治疗大多是根治性手术切除加术后辅助化疗，给病人及家庭造成巨大的经济负担和精神负担[3-5]。因此，研究骨肉瘤细胞增殖和迁移的发生机制，寻求新的治疗靶点意义重大。Slit是神经导向因子家族的一员，它通过与其受体Robo结合，构成Slit-Robo信号通路，在细胞迁移、炎性反应、肿瘤发生及器官发育等过程中发挥重要的调控作用[6-9]。针对人神经营养导向因子2(Slit2)基因在骨肉瘤中作用的研究较少。本研究采用慢病毒干扰RNA(shRNA)技术沉默Slit2基因，探讨Slit基因以及Robo信号通路在细胞中的作用机制，以期为骨肉瘤的治疗提供新的靶点。
1 材料与方法 1.1 骨肉瘤MG63细胞的培养本文实验以骨肉瘤MG63细胞为种子靶细胞，以2×104/cm2的密度将其种植于25 cm×25 cm的培养瓶中，加入含体积分数0.01胎牛血清的RPMI-1640培养液(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)，之后将细胞在37 ℃、含体积分数0.05 CO2、100%湿度条件下孵育。当细胞融合率为70%~80%时，以2.5 g/L胰蛋白酶消化处理后进行传代培养。取第2代细胞进行后续实验。
1.2 shRNA-Slit2慢病毒载体的构建与转染以及细胞分组载体质粒环状RNA(LV3)中的loop结构选用了TTCAAGAGA以避免形成终止信号。正义链模板的5′端添加了GATCC，与BamHⅠ酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5′端添加了AATTC，与EcoRⅠ酶切后形成的粘端互补。正义连：5′-GATCC-(GN18)-(TTCAAGAGA)-(N18C)-TT-TTTTG-3′；反义链:3′-G(CN18)-(AAGTTCTC-T)-(N18G)-AAAAAACTTAA-5′。将DNA oligo分别采用TE(pH值8.0)溶解，浓度为100 μmol/L。取相应的正、反义链oligo溶液，在PCR仪上按照如下程序进行退火处理：95 ℃、5 min; 85 ℃、5 min; 75 ℃、5 min; 70 ℃、5 min; 4 ℃保存。得到浓度为10 μmol/L的shRNA模板。将所得模板溶液稀释50倍，终浓度为200 μmol/L，用于连接反应。根据上述慢病毒转染载体的构建原则，构建目的基因的shRNA-Slit2慢病毒(包含插入位点)的ZsGreen荧光蛋白标记基因序列。克隆的寡核苷酸可以在离体shRNA中产生pGLV3/H1/ZsGreen+Puro载体(8 kb)。设计的shRNA-Slit2的引物序列见表 1。通过限制映射和DNA测序确定shRNA的成功构建。慢病毒载体经过36 h的转导后收集并进行离心，清除细胞碎片。慢病毒的效价为5.0×1010 TU/L。
| 表 1 目的基因的引物序列 |
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将骨肉瘤MG63细胞随机分成3组：空白对照组(不转染慢病毒，A组)、空白载体病毒组(转染含空白质粒载体的慢病毒，B组)、shRNA-Slit2载体病毒组(转染含shRNA-Slit2质粒载体的慢病毒，C组)。
1.3 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测Slit2、Robo4、Caspase-3和Caspase-9的mRNA相对表达水平将3组骨肉瘤MG63细胞经2.5 g/L的胰蛋白酶处理，收集入15 mL离心管，5 000 r/min离心。取细胞沉淀，加入1 mL的Trizol试剂(TaKaRa, Japan)裂解细胞，提取细胞总RNA，应用PCR酶标仪检测其纯度，保证提取RNA纯度为1.9~2.0，用于后续实验。根据逆转录试剂盒(TaKaRa, Japan)说明书将RNA逆转录为cDNA，-20 ℃下保存。根据SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒(Perfect Real-Time, TaKaRa, Japan)说明书的要求进行加样处理，行RT-qPCR检测。根据预实验结果，将反应体系条件设置为：95 ℃、30 s；1个循环。PCR：95 ℃、5 s；60 ℃、30 s，40个循环。溶解曲线：95 ℃、5 s；60 ℃、1 min。降温：50 ℃、30 s, 1个循环。然后应用FTC-2000 RT-qPCR系统分析Slit2、Robo4、Caspase-3和Caspase-9的基因表达量。内参基因GAPDH和Slit 2、Robo4、Caspase-3、Caspase-9的引物序列均由上海生工公司设计。见表 1。采用2-△△Ct方法计算目的基因的相对表达量。
1.4 Western-blot检测Slit2、Robo4、Caspase-3和Caspase-9的蛋白表达量各组骨肉瘤MG63细胞融合率为80%以上时，PBS冲洗3次，加入RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制剂混合液(100:1)，于冰上裂解1 h，细胞刮刮取细胞，超声裂解，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液加入上样缓冲液于95 ℃水浴10 min，-80 ℃保存。BCA比色法测定蛋白浓度，定量上样进行80 g/L的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酸胺凝胶(SDS-PAGE)电泳2.0 h。转膜后加一抗稀释液(抗体稀释配比为1:1 000；Santa Cruz Biotechnology, 美国) 4 ℃孵育过夜，24 h后用PBS洗膜10 min共3次，后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(抗体稀释配比为1:2 000，碧云天，中国) 37 ℃孵育1 h，洗膜，化学发光试剂显色1 min，置暗盒内，X线显影、定影后曝光。以β-actin作为内参照。应用Quantity one 4.6软件测量各条带的吸光度(A)值，以其表示蛋白含量。
1.5 Transwell小室实验检测细胞的迁移将3组细胞经胰蛋白酶消化后收集，按照试剂盒说明书方法，将基底膜的基质原液放在冷藏冰箱(4 ℃)过夜融化，然后与预冷的无血清的RPMI-1640按照1:3的比例配制侵袭上室凝胶液体，以每孔55 μL的量包被Transwell小室的上室，放置在37 ℃的孵育箱，2 h后使上室成胶。然后，在上室每孔接种200 μL不含血清的细胞培养液，下室加入含体积分数0.10胎牛血清的RPMI-1640培养液500 μL。将Transwell板放置在37 ℃的孵育箱中培养24 h后用结晶紫染色，进行细胞计数。所有实验均重复3次。
1.6 CCK-8实验检测细胞的增殖收集3组经胰蛋白酶消化后细胞，按照CCK-8试剂盒说明书方法，以每孔50个的量接种在96孔板中，72 h后每孔加入10 μL的CCK-8试剂，放到37 ℃孵育箱中培养2 h。然后，应用酶标仪分别检测450 nm波长处吸光度值，每组设置3个复孔。所有实验均重复3次。
1.7 细胞凋亡检测收集3组经胰蛋白酶消化后细胞，按照AV-PI试剂盒说明书操作，检测3组细胞的凋亡率。流式细胞仪分析各组样本，计算3组细胞的凋亡率。Annexin V+/PI-为早期凋亡细胞，Annexin V+/PI+为晚期凋亡和坏死细胞，Annexin V-/PI+为正常细胞。所有实验均重复3次。
1.8 统计学方法应用SPSS 16.0软件进行统计学分析，计量资料结果用x±s形式表示，多组数据比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。以P＜0.05为差异有显著性。
2 结果 2.1 shRNA-Slit2载体的构建和转染以绿色荧光蛋白(GFP)为荧光探针，完成Slit2的RNA干扰慢病毒载体构建。shRNA-Slit2载体慢病毒转染滴度为3×1011TU/L，慢病毒转染效率为(91.07±4.33)%。
2.2 各组Slit2、Robo4和凋亡基因Caspase-3、Caspase-9的mRNA和蛋白表达比较各组Slit2、Robo4 mRNA和蛋白相对表达量比较差异有显著性(F=9.007~19.989, P＜0.05)，其中shRNA-Slit2载体病毒组低于空白载体病毒组(q=1.022~5.392, P＜0.05)。3组Caspase-3、Caspase-9 mRNA和蛋白相对表达量比较差异有显著性(F=8.349~9.078, P＜0.05)，其中shRNA-Slit2载体病毒组高于空白载体病毒组(q=1.997~3.142, P＜0.05)。见表 2。
| 表 2 各组Slit2、Robo4和凋亡基因Caspase-3、Caspase-9的mRNA和蛋白表达比较(n=3, x±s) |
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Transwell实验结果显示，空白对照组、空白载体病毒组和shRNA-Slit2载体病毒组迁移细胞数比较，差异有统计学意义(F=31.982，P＜0.05)；其中shRNA-Slit2载体病毒组低于空白载体病毒组(q=2.983, P＜0.05)。见表 3。
| 表 3 各组迁移细胞数、细胞增殖率和细胞凋亡率比较(n=3, x±s) |
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CCK-8检测结果显示，空白对照组、空白载体病毒组和shRNA-Slit2载体病毒组细胞增殖率比较，差异有统计学意义(F=23.983，P＜0.05)，其中shRNA-Slit2载体病毒组低于空白载体病毒组(q=3.982, P＜0.05)。见表 3。
2.5 各组细胞凋亡率比较AV-PI检测结果显示，空白对照组、空白载体病毒组和shRNA-Slit2载体病毒组细胞凋亡率相比较，差异有统计学意义(F=30.009，P＜0.05)，其中shRNA-Slit2载体病毒组高于空白载体病毒组(q=8.311, P＜0.05)。见表 3。
3 讨论骨肉瘤是骨肿瘤科常见的恶性肿瘤，其恶性度比较高，有关研究显示根治术辅助化疗后其5年生存率并没有明显的提高[10-13]。骨肉瘤细胞的恶性增殖以及癌细胞迁移是造成肿瘤病情进展的关键原因之一[14-16]，故了解骨肉瘤细胞增殖、迁移以及凋亡机制具有重要的临床意义。本文研究探讨shRNA-Slit2基因对骨肉瘤MG63细胞增殖、迁移和凋亡的影响及其机制，以期为临床骨肉瘤的治疗提供新的治疗靶点。结果显示，shRNA-Slit2可以通过Robo信号通路抑制骨肉瘤MG63细胞增殖及迁移，促进其凋亡，提示Slit2可以作为骨肉瘤治疗的潜在靶点，为临床上骨肉瘤的治疗提供一个新的思路。
Slit是神经导向因子家族的一员，它通过与其受体Robo结合，构成Slit-Robo信号通路，在细胞迁移、炎性反应、肿瘤发生及器官发育等过程中发挥重要的调控作用[17-19]。既往研究显示，Slit2/Robo4信号通路在炎性递质表达和平滑肌细胞增殖中有促进作用[20-21]。提示Slit2/Robo4信号通路调控细胞增殖和凋亡。然而，Slit2/Robo4信号通路在骨肉瘤MG63细胞中的作用尚未见报道。本文研究以慢病毒作为转染媒介，介导siRNA干扰质粒，转染骨肉瘤细胞，探讨Slit2/Robo4信号通路在骨肉瘤细胞增殖、迁移和细胞凋亡中的作用及其机制。结果显示，慢病毒转染效率均高于90%，说明慢病毒转染具有很好的转染性。RT-qPCR和Western-Blot结果显示，shRNA-Slit2载体病毒组Slit2、Robo4的mRNA和蛋白表达水平低于空白载体病毒组，差异有显著意义；而凋亡相关因子Caspase-3、Caspase-9的表达明显高于空白载体病毒组，从基因层面和蛋白层面证明将Slit2基因沉默后，Robo-4明显降低，shRNA-Slit2可以促进骨肉瘤细胞的凋亡，其作用是通过Robo4信号通路实现的。
目前对于肿瘤细胞的行为学特征研究，主要集中于肿瘤细胞的迁移、增殖和凋亡[22-24]。当然也有的研究聚焦于肿瘤细胞的自噬[25-26]。而寻求关键分子对于肿瘤的行为学影响特点，是分子生物学普遍应用的办法[27-28]。如郑颖等[29]探讨鸦胆子素对骨肉瘤的影响，结果显示鸦胆子素可以抑制骨肉瘤的增殖，促进骨肉瘤细胞的凋亡，提示鸦胆子素可以作为一种新的骨肉瘤治疗药物。本文的研究结果则显示，shRNA-Slit2载体病毒组骨肉瘤细胞的迁移数明显低于空白载体病毒组，差异有统计学意义，说明shRNA-Slit2可以明显抑制骨肉瘤MG63细胞的迁移。本文增殖实验结果显示，shRNA-Slit2载体病毒组骨肉瘤细胞的增殖率明显低于空白载体病毒组，差异有统计学意义，说明shRNA-Slit2可以明显抑制骨肉瘤MG63细胞的增殖。AV-PI凋亡检测结果显示，shRNA-Slit2载体病毒组骨肉瘤细胞的凋亡率明显高于空白载体病毒组，差异有统计学意义，说明shRNA-Slit2可以明显促进骨肉瘤MG63细胞的凋亡。另外，本研究还分别检测了凋亡基因Caspase-3和Caspase-9 mRNA和蛋白表达，研究结果显示，将Slit2基因沉默表达后，Caspase-3和Caspase-9的表达明显增高。以上结果表明，Slit2基因在骨肉瘤MG63细胞的迁移、增殖以及凋亡中起重要的作用，可能成为骨肉瘤的潜在治疗靶点。
综上所述，shRNA-Slit2可以通过Robo信号通路抑制骨肉瘤MG63细胞增殖及迁移，促进其凋亡。为临床上骨肉瘤的治疗提供新的靶点，为骨肉瘤的治疗提供新的思路与方法。
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