骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有多向分化潜能，在特定环境下，可以分化成人体内的各种细胞，比如软骨细胞、骨细胞以及神经细胞等^[1-4]。研究结果显示，BMSCs在特定诱导条件下可以转化成神经细胞，进而能促进神经损伤的修复；而且BMSCs来源于病人自体，移植后可以避免排斥反应^[5]；另外，BMSCs能分泌多种细胞因子，这为神经的修复提供了一个新的思路^[6]。分泌型糖蛋白神经生长导向因子2(Slit2)是中枢神经系统发育过程中的一种轴突导向抑制因子，可控制神经轴突分支形成以及神经细胞迁移，能促进BMSCs向感觉神经元分化, 参与损伤神经再生和功能修复^[7-9]。近年来，在交通事故中发生的神经损伤和脊髓损伤比较常见，而针对神经损伤的治疗一直是临床上的难点。本研究将Slit2过表达载体以慢病毒介导入BMSCs内，探讨慢病毒介导Slit2过表达转染促进BMSCs向神经细胞转化的作用，从而为临床神经损伤病人治疗提供新的思路。

1 材料与方法 1.1 实验材料

胎牛血清购自Gibco公司；DMEM及2.5 g/L胰酶Trypsin购自美国Invitrogen公司；Trizol购自美国Invitrogen公司；氯仿、乙醇及逆转录试剂盒购自美国ABI Applied Biosystems公司；Real-time PCR仪购自美国bio-rad公司。

1.2 实验方法 1.2.1 人BMSCs的分离和培养

选取20名健康志愿者，男8例，女12例，年龄为20~38岁，平均(27.48±7.83)岁。实验方案获得了本院伦理委员会的批准，所有志愿者均签署知情同意书。志愿者术前查体，排除肝炎、性病、艾滋病等传染性疾病；术中取俯卧位，暴露双侧髂后上棘，消毒，铺巾，以利多卡因20 mL局部麻醉，利用骨穿刺针采集志愿者的新鲜骨髓，按照1:3体积比加入含0.01 mol/L胎牛血清、100 kU/L青霉素的DMEM细胞培养液，充分混匀后，移入25 cm²的Hank培养瓶中，采用差速培养法培养，3 d后去掉培养瓶中的油脂等杂质，之后每3 d换1次细胞培养液。BMSCs细胞融合率达70%~80%后进行传代培养。

1.2.2 BMSCs的鉴定

采用流式细胞仪检测第2代BMSCs表面蛋白CD29、CD44、CD71、CD90和CD106的表达；采用倒置光学显微镜观察BMSCs的细胞形态。

1.2.3 慢病毒Slit2过表达载体构建

慢病毒Slit2过表达载体由上海吉凯基因化学技术有限公司合成，选择pHBLV-U6-ZsGreen-PGK-Puro作为质粒克隆载体。慢病毒Slit2过表达载体克隆切入点为XhoI/BamHI，编号为ENST00000005893。

1.2.4 慢病毒细胞转染和实验分组

取第3代BMSCs进行实验。将细胞接种到6孔板，待细胞融合率为50%时进行慢病毒转染，根据转染说明书，MOI=50，慢病毒滴度为3×10⁷。将BMSCs细胞分成3组。空白对照组：未转染慢病毒；空白载体慢病毒组：转染不含Slit2过表达载体慢病毒；Slit2过表达载体慢病毒组：转染Slit2过表达载体慢病毒。

1.2.5 实时荧光定量PCR(RFPCR)检测神经胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)mRNA表达

3组细胞融合率达80%，用2.5 g/L胰蛋白酶消化后放入15 mL离心管中，加入1 mL的Trizol RNA iso(Takara, 日本)，利用Trizol萃取法，提取总RNA。利用逆转录试剂盒逆转录目的RNA, 将得到的cDNA保存在－80 ℃冰箱中。根据荧光定量PCR试剂盒说明书要求，反应体系为25 μL，内含：SYBR Premix Ex Taq^TMⅡ(2×) 12.5 μL，PCR Forward Primer(10 μmol/L) 1.0 μL，PCR Reverse Primer(10 μmol/L) 1.0 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH₂O 8.5 μL。应用FS 2000系统PCR仪器对25 μL的反应体系进行分析，采用两步法PCR反应程序，反应时间选择120 min; 其中预变性：95 ℃、30 s；Circle 1：95 ℃、30 s；Circle 2：60 ℃、30 s；溶解曲线：95 ℃、5 s，60 ℃ 1 min；降温：50 ℃、30 s。记录各样本的CT值。内参基因引物由上海生工公司合成。见表 1。用2^-△△CT法计算GAPDH、GFAP和NSE的相对表达量。

1.2.6 Western-blot检测GFAP和NSE的相对蛋白表达水平

3组细胞处理后，分别加入RIPA细胞裂解液1 mL，在冰上裂解30 min，收集入1.5 mL的离心管中，在4 ℃预冷的离心机中离心(5 000 r/min，5 min)，提取上清，经95 ℃煮沸后，收集蛋白备用。制备浓缩胶10 mL，分离胶20 mL。上样后电泳分离，转膜后在4 ℃冰箱中避光孵育过夜(>12 h)。GFAP和NSE小鼠抗人一抗(Abcam公司)1:10 000稀释后加入样本离子膜；第2天用PBST稀释液洗膜，重复3次，用山羊抗小鼠IgG二抗(碧云天公司)1:1 000稀释后孵育1.5 h，使用PBST稀释液洗膜，重复3次，然后用DAB显影液进行显影。应用Image J软件分析蛋白条带。

1.3 统计学方法

应用SPSS 16.0软件进行统计学分析，计量资料结果以x±s形式表示。多组数据间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验。

2 结果 2.1 人BMSCs的培养和鉴定

接种48 h后，原代BMSCs开始贴壁，细胞呈梭形或者多角形；培养至第2代细胞呈旋涡状或者辐射状生长，细胞增殖迅速。流式细胞仪检测显示，第2代BMSCs表面蛋白CD44和CD29表达率分别为60.2%和58.3%，CD34和CD45表达率分别为3.4%和2.6%。

2.2 慢病毒介导Slit2过表达质粒转染BMSCs

结果显示，慢病毒的转染效率较高，为90%以上，可以在最大程度上发挥Slit2的过表达作用。

2.3 各组GFAP、NSE mRNA和蛋白表达比较

空白对照组、空载体病毒组和过表达载体病毒组的GRAP、NSE mRNA水平和蛋白表达量比较差异有统计学意义(F=9.089~13.893，P＜0.05)，其中空载体病毒组和空白对照组比较差异无显著性(P>0.05)；过表达载体病毒组和空载体病毒组相比较，差异均有统计学意义(q=2.001~3.897，P＜0.05)。见表 2。

3 讨论

近年来，随着交通事故的多发，在交通事故中发生的神经损伤和脊髓损伤比较常见^[10-12]，而针对神经损伤的治疗一直是临床上的难点^[13]。BMSCs具有多分化潜能，最近有研究表明，BMSCs可以分化成神经细胞^[14-18]。在神经导向因子Slit2的刺激下，BMSCs可转化成神经细胞，但是效率不高^[19-20]。本研究利用基因过表达技术，构建Slit2的过表达载体，再利用高转染效率的慢病毒转染BMSCs，探讨BMSCs向神经细胞高效率转化的实验方法，为临床上神经损伤和脊髓损伤提供种子细胞。

Slit2是神经发育过程中引起神经细胞生长的神经导向因子^[21]。有研究结果表明，Slit2通过浓度梯度来介导神经细胞的迁移和生长，对神经细胞的生长起排斥性导向作用，同时还可促进感觉神经细胞的神经纤维分支形成^[22-24]。提示神经生长因子可以促进神经元谱系细胞的分化^[25]。本研究应用基因过表达技术构建Slit2过表达载体，应用慢病毒转染BMSCs，结果显示，慢病毒的转染效率较高，为90%以上，可以最大程度发挥Slit2的过表达作用。

GFAP和NSE均是神经细胞的标识蛋白，其中GFAP是星形胶质细胞活化的标志物，主要分布于中枢神经系统的星形胶质细胞，参与细胞骨架的构成并维持其张力强度^[26-27]。血清NSE是神经元和神经内分泌细胞所特有的一种酸性蛋白酶^[28]。本研究选用以上两种神经细胞的特异性标志物，采用RT-PCR和Western-blot的实验方法，从基因和蛋白两个层面上检测空白对照组、空载体病毒组和过表达载体病毒组的GRAP和NSE的表达水平，结果显示，过表达载体病毒组GRAP和NSE基因和蛋白的表达水平均明显高于空载体病毒组和空白对照组，差异有统计学意义。从而可以证明从基因水平上将Slit2的过表达载体通过慢病毒介导的方法转染BMSCs，可以提高BMSCs向神经细胞的转化效率，故而神经细胞的标记物GFAP和NES的表达量明显增高。

综上所述，Slit2过表达质粒可以提高BMSCs向神经细胞转化的效率，为临床上神经损伤和脊髓损伤治疗提供种子细胞。